facebook
twitter
vk
instagram
linkedin
google+
tumblr
akademia
youtube
skype
mendeley
Wiki
Global international scientific
analytical project
GISAP
GISAP logotip

Метод получения иммуногена на основе конъюгированных энтеротоксинов escherichia coli

Автор Доклада: 
Сухарев Ю.С., Сухарева С.Ю., Головин И.В.
Награда: 
Метод получения иммуногена на основе конъюгированных энтеротоксинов escherichia coli

УДК 619;616.98:579.842.11:631.147

МЕТОД ПОЛУЧЕНИЯ ИММУНОГЕНА НА ОСНОВЕ КОНЪЮГИРОВАННЫХ ЭНТЕРОТОКСИНОВ ESCHERICHIA COLI

Сухарев Юрий Станиславович, к. б. н., доцент
Харьковская государственная зооветеринарная академии
Сухарев Станислав Юрьевич, студент
Головина Ирина Владимировна, студент
Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина.

Разработан метод получения иммуногена на основе энтеротоксинов Escherichia сoli. Высокая специфичность иммуногена достигалась за счет использования нативных энтеротоксинов, где белки и полисахариды, входящие в состав гликопротеинового комплексаST-энтеротоксина, конъюгировали с LT-энтеротоксином, что приводило к образованию молекулы ведущей себя как Т-зависимый антиген, и индуцировало выраженный иммунный ответ со стороны антител как на белковую, так и на полисахаридную часть энтеротоксинов. 
Ключевые слова: Escherichia сoli, энтеротоксины, гаптен, конъюгат, иммуноген.

A method for getting of immunogen on the basis of enterotoxin Escherichia coli was devised. The high specificity of the immunogen was achieved through the use of native enterotoxins, where proteins and polysaccharides that make up the glycoprotein complex ST-enterotoxin conjugated with LT-enterotoxin, which led to the formation of the molecule behaving as a T-dependent antigen and induces an expressed immune response by antibody on a protein as well as on polysaccharide part of enterotoxins.
Keywords: Escherichia сoli, enterotoxins, hapten, conjugate, immunogen.

Широко распространенным инфекционным заболеванием новорожденных детей и молодняка сельскохозяйственных животных, которое вызывают патогенные Escherichia сoli,является колибактериоз, характеризующийся изнурительной диареей, быстрым обезвоживанием организма и явлениями токсикоза [1, 2, 3, 4].

Одним из ведущих элементов оценки патогенности Eoli является наличие у них генов, детерминирующих синтез энтеротоксинов - термостабильного (ST) и термолабильного (LT), [5, 6, 7].

Известно, что наиболее часто (в 40-50% случаев) энтеротоксигенные Eoli синтезируютST- или ST+LT+ (30-40%), реже – только LT - (20-30%), [8].

Из двух видов энтеротоксинов только LT обладает иммуногенными свойствами, тогда какST - является гаптеном, что существенно затрудняет получение к нему специфических антитоксических антител, [9].

Получение таких антител осложнено тем, что низкомолекулярные вещества, как правило, неиммуногенны и сами по себе не индуцируют антителообразование. Антигенные детерминанты таких веществ состоят из небольшого числа аминокислотных или углеводных остатков, [10].

Было показано, что молекулы гаптенов, конъюгированные с более крупным носителем (белками, полисахаридами, липидами и другими макромолекулами), индуцируют образование антител, обладающих необходимой специфичностью. Конъюгированные антигены индуцируют синтез антител, способных реагировать как с носителем, так и с гаптеном.

Существуют различные способы конъюгации гаптена с носителем. Часто для этой цели применяют диазопроизводные ароматических соединений – толуол - 2,4 - диизоцианат, 1 – этил - 1,3 (3 - диметил аминопропил) карбодиимид или пенициллин, обладающий способностью реагировать in vivo с белками через пенициллоил - лизиновую группу [11]. Однако, эти методы имеют ряд недостатков, в частности длительность получения и низкий выход конъюгатов, в следствие образования ковалентных связей между самими молекулами гаптена, а так же большого количества побочных продуктов.

Весьма удобным химическим линкером является глутаровый альдегид, который взаимодействует с ε-аминогруппами лизиновых остатков белков. К тому же, по мнению ряда авторов, именно глутаральдегид, в сравнении с другими веществами используемыми для конъюгации белков, в большей степени “щадит” иммунологическую активность полимеризуемых молекул [12].

Целью исследований была разработка метода конструирования иммуногена, на основе конъюгированных молекул энтеротоксинов, для индукции антитоксического иммунитета противтоксигенных E.coli.

Материалы и методы исследований. Приготовление конъюгата осуществляли следующим образом: 100 мг лиофилизированного LT растворяли в 2,0 мл 0,1 М фосфатного буфера с рН 6,8, который содержал 1,25% глутаральдегида.

Через 18 час экспозиции при комнатной температуре смесь наносили на хроматографическую колонку с сефадексом G-25, уравновешенную 0,15 М раствором хлорида натрия. Фракции, которые содержали активированный LT (экстинция при 403 нм) объединяли и концентрировали до 1/10 исходного раствора ПЭГ с молекулярной массой 3000 D. К этому раствору добавляли 50 мг ST, растворенного в смеси 10 мл 0,15 М хлорида натрия и 1,0 мл карбонат-бикарбонатного буфера. Через 24 час инкубации при температуре 4 °С добавляли 1,0 мл 0,2 М раствора лизина и на 2 час ставили на диализ против 0,1 М фосфатно-солевого буфера. Конъюгат центрифугировали 20 мин при 2000 g и сохраняли при температуре 4 °С. Количество связанного ST в конъюгате определяли по разнице исходной концентрации белка ST и остаточной в диализате.

Иммуногенные свойства конъюгата энтеротоксинов E.coli изучали на белых беспородных мышах массой 14-16 г. Мышей прививали подкожно, дважды, в дозе 0,3 мкг/мл (первая инъекция) и 0,5 мкг/мл (вторая инъекция) с интервалом между введениями 7 дней. На 21 сутки после ревакцинации определяли напряженность иммунитета путем интраперитонеальной инъекции2Dlm токсинов гомологичных и гетерологичных штаммов E.coli. Конъюгат считали иммуногенным когда в живых оставалось более 50% опытных животных.

Результаты исследований и их обсуждение. Механизм реакции глутаральдегида с белками до конца не изучен. Одновременно протекает несколько реакций, приводящих к появлению смеси продуктов, содержащих более прочные химические связи, чем в простых основаниях Шиффа. Однако в общем виде схему реакции можно представить в следующем виде:

1. ε-NH2+O=CH (CH2)3CH=O→ε-N=CH (CH2)3CH=O;

2. ε-N=CH (CH2)3CH=O+NH2-белок→ε-N=CH (CH2)3CH=N-белок.

Далеко не все комплексы гаптенов с белками являются одинаково хорошими иммуногенами. К числу факторов, усиливающих иммунный ответ на конъюгат, относятся высокая плотность молекул гаптена на молекуле носителе и использование носителей, обладающих собственной иммуногенностью, [13].

Новизна предлагаемого решения заключалась в получении иммуногена, высокая специфичность которого достигалась за счет использования нативных энтеротоксинов, где белки и полисахариды, входящие в состав гликопротеинового комплекса ST, конъюгировали с LT, что приводило к образованию молекулы ведущей себя как Т-зависимый антиген, и индуцировало выраженный иммунный ответ со стороны антител как на белковую, так и на полисахаридную часть энтеротоксинов.

В этом случае гаптен выступал в роли доминантной иммунодетерминанты и антитела образовывались преимущественно к гаптену.

Известно, что функция носителя гаптена заключается в стимуляции Т-хэлперов, помогающих В-клеткам реагировать на гаптен. При использовании конъюгата гаптена с белками в качестве носителя установлено, что Т-клетки отвечают на носитель (Т-клеточный эпитоп), в то время как В-клетки – на гаптен (В-клеточный эпитоп), [14].

В опытах in vitro показано, что чистая популяция В-клеток отвечает на гаптен только пролиферацией, но при этом неспособна пройти весь путь развития до зрелых, продуцирующих антитела плазмацитов. Внесение в культуру Т-клеток и макрофагов обеспечивает продукцию специфических антител, [15].

Конъюгированные гаптены в кишечнике млекопитающих распознаются специальными М-клетками, которые широко представлены в толще слизистого эпителия. М-клетки транспортируют захваченный антиген к перитонеальным макрофагам и В-лимфоцитам, находящимся в лимфоидных образованиях тонкого кишечника (пейеровых бляшках). В результате презентации антигена на поверхности антиген-презентирующих клеток происходит активация T-лимфоцитов-хэлперов, которые в сочетании с антигеном активируют В-лимфоциты. Дифференцированные В-клетки выходят из лимфоидных фолликулов слизистой оболочки и поступают через общую циркуляцию в мезентеральные лимфатические узлы, где происходит их созревание и превращение в плазматические клетки, синтезирующие специфические к антигену антитела, [16], (рис.).

 Рис. Схема иммунной реакции индуцированная конъюгатом энтеротоксинов E.coli.

Установили, что основным фактором влияющим на количественное содержание ST в конечном конъюгате являлось начальное соотношение LT/ST вступающих в реакцию. Так при соотношении – 2:1, количество ST в конечном конъюгате было максимальным и составляло 98,25 ± 1,29%, тогда как при соотношении 1:2 этот показатель был минимальным - 24,25 ± 1,30%.

Конъюгат энтеротоксинов обладал иммуногенными свойствами. Иммунизированные им белые мыши были защищены от 2Dlm ST- и LT-энтеротоксинов гомологичных и гетерологичных штаммов E.coli, (табл.).

Таблица.

Количество иммунизированных конъюгатом мышей (n=40) выживших после инъекции 2Dlm ST- и LT-энтеротоксинов гомологичных и гетерологичных штаммов E.coli.

Количество иммунизированных мышей (%) выживших после инъекции

2Dlm ST-энтеротоксина

(Х±sn=5)

2Dlm LT-энтеротоксина

(Х±sn=5)

гомологичного

штамма

гетерологичного

штамма

гомологичного

штамма

гетерологичного

штамма

96,0 ± 0,08

93,6 ± 0,07

86,6 ± 0,06

80,0 ± 0,04

Выводы. Добавление к ранее модифицированному носителю ST-энтеротоксина, исключало ковалентное связывание молекул гаптена между собой (ST-ST), препятствующее образованию достаточного количества конъюгата и ускоряло получение конечного продукта.

Метод дает возможность увеличить специфичность иммуногенов, минимизировать число процедур, уменьшить трудоемкость и использование дорогостоящего оборудования и реактивов.

Результаты свидетельствуют о высокой эффективности иммуногена на основе конъюгированных молекул энтеротоксинов, который с успехом можно использовать для индукции антитоксического иммунитета к энтеротоксинам E.coli.

Литература:

  • 1. Thapar N. Diarrhoea in children: an interface between developing and developed countries /N. Thapar, I. Sanderson // Lancet. - 2004. - Vol. 363. - P. 641 -653.
  • 2. Girard M. A review of vaccine research and development: human enteric infections /M. Girard, D. Steele, C. Chaignat, M. Kieny //Vaccine. - PMID 16483695. - 2006. - 24 (15). - P. 2732 - 2750.
  • 3. Шпонько Ю.Б. Совершенствование методов лечения и профилактики эшерихиоза поросят / Ю.Б. Шпонько //Ветеринарная патология. - 2007. - №1. – С. 20.
  • 4. Wingate D. Guidelines for adults on self-medication for the treatment of acute diarrhea /D. Wingate //Aliment. Pharmacol Ther. - 2001. - 15. - P. 773 - 782.
  • 5. Feng P. Diarrheagenic Escherichia coli /P. Feng //Bacteriological Analytical Manual September. - 2002. -8th Edition.
  • 6. Иванов А.С. Современные подходы к микробиологической диагностике и терапии инфекционных диарей /А.С. Иванов //Болезни органов пищеварения. – 2004. - №2. – С.12- 15.
  • 7. Олійник Л.В. Система моніторингу, контролю і профілактики токсикоінфекцій сальмонельозної та ешерихіозної етіології /Л.В. Олійник // Автореф. дис.... док. вет. наук.: 16.00.09./Львів. Нац. Акад. ветер. мед. ім. С.З. Гжицького. - 2004. - 21с.
  • 8. Qadri F. Prevalence of toxin types and coionization factors in enterotoxigenic Escherichia coli isolated during a 2-year period from diarrheal patients in Bangladesh /F.Qadri, S.K.Das, A.S.Farugue, et al. //J. Clin. Microbiol. -2000. - 38(1). - P.27 - 31.
  • 9. Алексанкин А. П. Разработка иммунохимических методов диагностики LT-подобных токсинов //Автореф. дис.... канд. биол. наук.: 03.00.23./НИИ морфолог. человека РАМН. - 2006. – 25 с.
  • 10. Галактионов В.Г. Иммунология /В.Г. Галактионов. – Академия. – 2004. – С.15.
  • 11. Сухарев Ю.С. Энтеротоксины Escherichia coli (методы получения, очистки, изготовление иммунизирующих препаратов, антитоксических сывороток и диагностических тест-систем на их основе /Ю.С. Сухарев. - Харьков. - 2009. – 91 с.
  • 12. Coico R. Immunology /R. Coico, G. Sunshine, E. Benjamini //A Shot Cours. – Wiley – Liss. – 2008. – 365 p.
  • 13. Ройт А. Распознавание антигена /А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл // Иммунология. – М: Мир. – 2000. – С.149 – 161.
  • 14. Sarzotti M. Induction of protective CTL responses in newbon mice by a murine retrovirus /M. Sarzotti //Scince. – 1996. – 271. – P.1726 – 1728.
  • 15. Хаитов P.M. Взаимодействие клеток иммунной системы: физиологические и медицинские аспекты иммунитета /P.M. Хаитов //Аллергия и клин. иммунология. — 1999. - №1. - С. 6 – 20.
  • 16. Хаитов P.M. Иммунология /P.M. Хаитов, Г.А. Игнатьева, И.Г. Сидорович. — М.: Медицина. - 2000. — 430 с.
6.25
Ваша оценка: Нет Средняя: 6.3 (4 голоса)

актуальное

актуальное исследование на сегоднейшний день

Благодарность

Благодарю за положительный отзыв и понимание проблемы! С уважением Сухарев Ю.С.
Сухарев Ю.С
Партнеры
 
 
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
Would you like to know all the news about GISAP project and be up to date of all news from GISAP? Register for free news right now and you will be receiving them on your e-mail right away as soon as they are published on GISAP portal.