facebook
twitter
vk
instagram
linkedin
google+
tumblr
akademia
youtube
skype
mendeley
Wiki
Global international scientific
analytical project
GISAP
GISAP logotip

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИЯХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

Автор Доклада: 
Болтина И.В.
Награда: 
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИЯХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

УДК 576.316

 

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КУЛЬТУРЫ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ПРИ ИССЛЕДОВАНИЯХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

 

Болтина Ирина Владимировна, канд. биол. наук, старший научный сотрудник
ГП Институт экогигиены и токсикологии им. Л.И. Медведя

 

В статье приведены результаты использования культуры лимфоцитов периферической крови при исследовании фармакологических препаратов. Описаны эксперименты по изучению мутагенных и антимутагенных свойств. Описано использование «преинкубации» для доказательств антимутагенных свойств сорбентов на примере Энтеросгеля. Приведена целесообразность использования цитогенетических показателей при клинической апробации препаратов. Поставлен вопрос о комплексном обследовании при изучении препаратов. Описана модификация препаратом in vitro культур лимфоцитов периферической крови больных для прогноза применения препарата.
Ключевые слова: лимфоциты периферической крови, фармпрепараты, мутагенные и антимутагенные свойства.

The article the results of the use of culture of peripheral blood lymphocytes for researches of pharmacological preparations. Experiments are described on a study their mutagenicity and antimutagenicity properties. The use is described «preinkubatziya» for proofs of antimutagenicity properties of sorbents on the example of Enterosgel’. Expedience of the use of cytogenetic indexes is resulted during clinical approbation of preparations. A question is put about a complex inspection at the study of preparations. Modification is described by preparation of in vitro cultures of peripheral blood lymphocytes of patients for the prognosis of application of preparation.
Keywords: of peripheral blood lymphocytes, pharmacological preparations, mutagenicity and antimutagenicity properties

 

В стандартную схему испытаний лекарственных препаратов, которая включает в себя четыре теста, входит и учет хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов человека – цитогенетический тест in vitro, который направлен на выявление индукции хромосомных нарушений в культивируемых клетках, в данном случае – лимфоцитов периферической крови. Метод изучения хромосом на стадии метафазы является наиболее информативным, поскольку он позволяет исследовать весь спектр структурных и количественных повреждений хромосом. Это один из наиболее отработанных, стандартизированных и распространенных методов, который дает возможность достаточно объективно сравнивать полученные результаты других авторов.

Материалы и методы. В лаборатории мутагенеза проводятся испытания мутагенной активности фармпрепаратов в лимфоцитах периферической крови человека in vitro без и с метаболической активацией. В условиях эксперимента без метаболической активации регистрируют действие прямых мутагенов – соединений, которые индуцируют мутации за счет активности первичной структуры исследуемого вещества. Действие же промутагенов – соединений, эффект которых обусловлен образованием мутагенных метаболитов – регистрируют в вариантах эксперимента с метаболической активацией.

Лимфоциты периферической крови культивировали соответственно общепринятому методу Хангерфорда на протяжении 52 часов, что позволяло исследовать клетки первого митоза. Отбор метафазных пластинок для цитогенетического анализа, классификация и метод подсчета аберраций хромосом были общепринятыми. Для цитогенетического анализа использовали метафазные пластинки без перекрещиваний хромосом, которые содержали 46 + 2 хромосомы – для фоновой частоты аберраций и от 34 до 93 хромосом – для количества анеуплоидных клеток. Мультиаберрантными клетками считали такие, которые имели 3 и больше аберраций. Учитывали аберрации хроматидного и хромосомного типов. Пробелы отмечали, но в число аберраций не включали. Проводили анализ зашифрованных препаратов, окрашенных рутинным методом. В каждой концентрации анализировали не менее 200 метафаз.

Для изучения антимутагенного эффекта препараты культивировали совместно с положительными контролями, которые применялись конкретно для каждого случая: Митомицином – С (эксперименты без активации) или Циклофосфаном (эксперименты с активацией).

Учитывают следующие цитогенетические показатели: частоту аберраций, количество анеуплоидных, мультиаберрантных и полиплоидных клеток; спектр аберраций и ПАК (поврежденность аберрантной клетки).

Результаты исследований и их обсуждение. За время существования лаборатории были «проверены» на мутагенность по стандартным схемам такие фармпрепараты, как Пиродазол, Амизон, Супер Эрбисол, Эрбисол?Ультрафарм, Энтеросгель. Ни один из вышеперечисленных препаратов не обладал мутагенной активностью.

При изучении препаратов Супер Эрбисол, Эрбисол?Ультрафарм и Энтеросгель были выявлены их антимутагенные свойства. Препараты Супер Эрбисол и Эрбисол?Ультрафарм являются метаболическими антимутагенами, т.е. действуют только при наличие ферментативной системы цитохромов Р 450. Во время изучения мутагенной/антимутагенной активности препарата Эрбисол?Ультрафарм проводились обследования больных с фибромиомами. А так как препарат рекомендовался при лечении этого заболевания, была проведена модификация in vitro культур лимфоцитов периферической крови Эрбисол?Ультрафармом. В результате (в условиях эксперимента с метаболической активацией) получено статистически достоверное снижение частоты аберраций хромосом и количества анеуплоидных клеток в культурах лимфоцитах периферической крови больных по сравнению с контролем (без добавления препарата). Это может свидетельствовать о способности препарата предупреждать возникновение изменений в геноме человека и обеспечивать его стабильность.

Учитывая способность препарата Энтеросгель адсорбировать продукты незавершенного метаболизма при исследовании его антимутагенных свойств, было принято решение проводить модифицированный эксперимент – «преинкубацию», которая состояла в том, что клетки крови человека обрабатывались Митомицином–С, а через три часа после «отмывания» мутагена, воспроизводилась стандартная схема культивирования. Сорбент Энтеросгель (паста для перорального применения) в культуру лимфоцитов периферической крови человека добавляли за 48 и 24 часа до окончания инкубации. В результате установлено, что время действия сорбента не играет особой роли для проявления его антимутагенных свойств,

Антимутагенные свойства связаны с количеством сорбента, который «участвует» в эксперименте. Энтеросгель исследовали в концентрациях 10,0 мг/мл – максимальная концентрация за весь курс для человека; 5,0 мг/мл – обычный курс лечения для человека, 2,50 мг/мл – доза, превышающая суточную в 4 раза; 1,25 мг/мл – двойная суточная доза; 0,625 мг/мл – суточная доза для человека. Достоверная разница цитогенетических показателей по сравнению с контролем (обработка Митомицином-С), а именно: частоты метафаз с аберрациями, анеуплоидных и мультиаберрантных клеток наблюдалась при двух высших используемых концентрациях (10,0 и 5,0 мг/мл). Таким образом, энтеросорбент Энтеросгель (паста для перорального применения) производства ЗАО ЭОФ “КРЕОМА-ФАРМ” обладает антимутагенными свойствами. Вполне возможно, что это открывает новые подходы к использованию препарата для профилактики поражений слизистой ЖКТ, вызванных, например, радионуклидной нагрузкой, а также некоторыми другими производственными факторами, обладающими мутагенным эффектом.

Для исследования фармпрепаратов была предложена схема использования культуры лимфоцитов периферической крови человека в качестве «контрольного» параметра для изучения действия препарата до и после его применения. Впервые эта схема была опробована при комплексном генетико-токсикологическом обследование лиц, принимавших БАД VAKORAI. В результате комплексных обследования добровольцев, принимавших препарат VAKORAI (изготовитель Натур Продукт) содержащий Zingiberis radix, Coriander fructose, Malve folium, Majorane herba, Myristicae arillus, установлены тенденции к снижению следующих показателей: частоты аберраций хромосом, содержания хлорорганических пестицидов и их метаболитов, тяжелых металлов в крови; снижение уровня мутагенности мочи (на основании двух тестов – Эймса и лимфоцитов периферической крови), и повышении уровня нитратов и суммарного содержания хлорорганических пестицидов в моче, что может свидетельствовать о выведении их из организма. В результате из этого комплекса были вычленены наиболее значимые параметры, среди которых были отмечены цитогенетические показатели.

В дальнейшем культура лимфоцитов периферической крови была задействована в процессе изучения частоты аберраций хромосом больных гепатитом С в процессе лечения препаратом Эрбисол?Ультрафарм. Был произведен забор крови у 52 больных с диагнозом – гепатит С, обратившихся в Институт эпидемиологии и инфекционных болезней им. Л.В. Громашевского, в отделение гепатитов. Специального подбора групп не проводилось. В основную (опытную) группу (32 пациента) попадали те лица, которые давали согласие на прием препарата. Не давшие согласие на участие в апробации препарата и соответственно лечившиеся по общепринятому методу, были отнесены к контрольной группе (20 человек). Забор крови производился до лечения, на 20, 70 и 120 день лечения. После двух курсов лечения (70 дней лечения) препаратом Эрбисол?Ультрафарм наблюдается достоверное снижение частоты аберраций хромосом, анеуплоидных и мультиаберрантных клеток и стабилизация этих показателей после третьего курса (120 дней лечения). Препарат Эрбисол?Ультрафарм эффективно действует на хромосомный аппарат больных гепатитом С после двух курсов приема.

Памятуя о проведенной модификации препаратом Эрбисол?Ультрафарм частоты анеуплоидных клеток в культурах лимфоцитов периферической крови больных фибромиомами, было решено добавить препарат в культуры лимфоцитов периферической крови больных и спрогнозировать действие субстанции. Это дало возможность сравнить прогнозируемые данные in vitro с «реальными» данными, которые получены после лечения препаратом.

Таблица

Частота метафаз с аберрациями хромосом в культуре лимфоцитов периферической крови обследованных пациентов без и с модификацией in vitro препаратом Эрбисол?Ультрафарм культур лимфоцитов периферической крови

 

Показатели

Частота метафаз с аберрациями, M ± m

Курс

Группы

Реальная, полученная в процессе лечения

При модификации препаратом in vitro

20 (один курс)

Опыт

13,3 ? 0,46

13,1 ? 0,80

Контроль

14,0 ? 0,65

14,5 ? 0,80

70 (два курса)

Опыт

5,70 ? 0,35

6,6 ? 0,41

Контроль

10,4 ? 0,68

9,4 ? 0,68

120 (три курса)

Опыт

4,90 ? 0,35

4,8 ? 0,37

Контроль

8,60 ? 1,00

7,1 ? 0,67

Дальнейший прогноз

Опыт

-

3,7 ? 0,30

Контроль

-

6,1 ? 0,90

 

Из таблицы видно, что данные, полученные при модификации культур лимфоцитов препаратом Эрбисол?Ультрафарм, в опытной группе находятся на одном уровне с полученными «реальными» результатами. Что же касается данных контрольной группы, то эти данные отличаются от «реальных», но не достоверно. Относительно же «дальнейшего прогноза», то в опытной группе частота аберраций при модификации достоверно ниже данных контрольной группы.

Проведенные исследования показывают возможность модификации препаратом Эрбисол?Ультрафарм культур лимфоцитов периферической крови обследованных пациентов для прогнозирования воздействия препарата. Безусловно, это довольно дорогостоящее решение проблемы, но, возможно при некоторых обстоятельствах – реальное.

Таким образом, использование культуры лимфоцитов периферической крови при исследованиях фармпрепаратов можно расширить:

  1. Одновременное определение мутагенных и антимутагенных свойств фармакологических препаратов сразу даст возможность расширить сферу применения лекарственных субстанций и дать им более детальную и углубленную характеристику.

  2. Применение индивидуального подхода к каждому фармакологическому препарату также дает возможность более углубленно изучить свойства лекарственных субстанций.

  3. Использование культуры лимфоцитов периферической крови в клинической апробации фармакологических препаратов расширяет возможности анализа свойств препаратов, и дает возможность «предсказывать» их действие при лечении больных.

5.57143
Ваша оценка: Нет Средняя: 5.6 (7 голосов)

Экспертная оценка

Представленный в статье материал вызывает интерес, поскольку актуальным остается, на сегодня, вопрос синтеза новых груп фармакологических препаратов особенно антибактериального действия и оценка их тератогенного влияния является важной составляющей. Интересен выбранный обьект исследования - лимфоцит, который собственно является ключевым звеном иммунной регуляции сложных патогенетических процессов в организме.

Исследование интересное и

Исследование интересное и актуальное. Уточните сколько человек явились донорами и была у них какая либо сопутствующая патология?

Эрбисол

Применение линии препаратов "Эрбисол" является перспективным направлением...См. раздел Токсикология...
Партнеры
 
 
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
Would you like to know all the news about GISAP project and be up to date of all news from GISAP? Register for free news right now and you will be receiving them on your e-mail right away as soon as they are published on GISAP portal.