facebook
twitter
vk
instagram
linkedin
google+
tumblr
akademia
youtube
skype
mendeley
Global international scientific
analytical project
GISAP
GISAP logotip
Перевод страницы
 

Вивчення Механізмів Дії Препарату Ізатізон на Репаративну Спроможність Клітин при Експериментальній Герпетичній Інфекції

Вивчення Механізмів Дії Препарату Ізатізон на Репаративну Спроможність Клітин при Експериментальній Герпетичній Інфекції
Ольга Ігорівна Болсунова, старший научный сотрудник, кандидат биологических наук

Анатолій Іванович Потопальський , кандидат медицинских наук

Институт оздоровления и возрождения народов Украины

Світлана Леонтіївна Рибалко , заведующий кафедрой, доктор медицинских наук, профессор

Леонід Андрійович Заїка, старший научный сотрудник, кандидат биологических наук

Участник первенства: Национальное первенство по научной аналитике - "Украина";

 

Вірус простого герпеса першого типу, штам VCпри взаємодії з пермісивною клітиною на ранніх стадіях інфекційного процесу індукує високий рівень репаративного синтезу ДНК (РС ДНК) внаслідок її інтенсивної деградації, яка виникає при взаємодії геномів вірусу і клітини. Ізатізон впливав на активність РС ДНК, виявляючи тим самим  противірусну дію.
Ключові слова: репаративний синтез ДНК, герпесвірусна інфекція, противірусний препарат, ізатізон.

Herpes simplex virusof the first type, strain VC under the interaction with permissive cell at early stages of infectious processinduces a high level of reparative DNA synthesis (RS DNA) because of cell’s intensive degradation that occurs during the interaction of virus’s and cell’s genomes. Isatizon is able to influence the activity of RS DNA, showing thereby antiviral effect.
Keywords: reparative DNA synthesis, herpesvirus infection, antiviral drug, isatizon.

У всьому світі спостерігається різке зростання числа вірусних та імуно-агресивних хвороб, які вважалися зниклими, і поява нових, серед яких значне місце посідають захворювання, викликані вірусами. Погіршення стану довкілля - суттєве навантаження на природні ресурси і людину, і є, водночас, причиною і наслідком зміни клімату. Це призводить, в решті-решт, до деградації навколишнього середовища та кризи стійкості живих організмів. Доволі важливим| є створення| та вивчення| препаратів, які безпосередньо| впливають| як на збудника| захворювання|, так і на імунну систему, нормалізуючи її дію.  Одним з таких препаратів є Ізатізон [1]. Він затверджений| Державним департаментом ветеринарної медицини України та Фармрадою| Росії як противірусний, протипухлинний|, антимікробний препарат з імунокорегуючими властивостями|. Ізатізон отримав дві срібні медалі на Міжнародних виставках у Москві  та в Будапешті у 1985 р. Препарат  активний щодо ДНК- та РНК-вмістних вірусів, має виразні імуномодулюючі властивості та протипухлинну активність, не токсичний, і не проявляє побічних ефектів [2]. Спектр дії включає: герпесвіруси, ортоміксовіруси, а саме| вірус грипу| А, А-1, вірус простого герпесу, герпес зостер|, хворобу Марека, інфекційного ларинготрахеїту птахів, бронхопневмонії коней та телят, вірус ектромелії та вісповакцини, вірус венесуельського| енцефаломієліту коней, вірус ентериту| свиней, ентеровіруси водоплавних| птахів, віруси поліомієліту, лімфолейкозу павіанів, віруси корисних| комах, рослин| та риб|, а також| мікроорганізми: стрептококи|, стафілококи, пневмококи|, патогенні та дріжжоподібні гриби|  та інше [3, 4, 5]. Широкий спектр противірусної дії ізатізона можна| пояснити| структурно-конформаційними особливостями препарату та пригніченням специфічних процесів репродукції вірусів [6]. Експериментально доведено, що препарат впливає як на віруси, так  і на клітинні механізми імунної системи [7]. Знайдено, що здатність препарату пригнічувати активність тимідинкінази вірусу герпеса і аденовірусу призводить до інгібування вірулентності вірусу на ранніх стадіях інфекційного процесу [8].  Також виявлено терапевтичну дію ізатізону при герпесі і аденовірусній інфекції та потенційну придатність препарату при СНІДі [7]. Одним з головних механізмів, контролюючих стійкість клітини щодо факторів фізичної, хімічної і біологічної природи, є репаративні системи клітин, які забазпечують відновлення пошкодженої ДНК. Залежно від характеристики системи вірус-клітина і типу перебігу інфекційного процесу, віруси здатні в деяких випадках збільшувати репаративну активність клітин, зменшувати її, або зовсім не змінювати [9].   

Репарація ДНК клітини – це фундаментальний матричний процес, який забезпечує підтримку клітинного гомеостазу. Дефекти в системі репарації ДНК, індуковані при розвитку вірусних інфекцій літичними та іншими ферментами вірусного чи клітинного походження, або безпосередньою взаємодією геному вірусу і ДНК клітини, можуть не повністю ліквідуватися. Це призводить до збільшення рівня цитогенетичних змін в клітинних системах, підвищення їхньої чутливості до мутагенних чинників і зниження функціональної активності.

Матеріали і методи

Герпесвірусні інфекції (ГВІ) належать до найбільш поширених вірусних хвороб, тому для скринінгу і вивчення антигерпетичної дії ізатізону була використана модель герпетичного менінгоенцефаліту. Ця модель зручна для оцінки виразності|виказаний,висловлений| симптоматики, відрізняється 100% відтворюваністю і не вимагає застосування|вживання| додаткових контролів. В роботі використовували ліофілізований| вірус герпесу простого 1 типу, штам VC з Інституту епідеміології і інфекційних хвороб ім. Л.В.Громашевського АМН України, інфекційний титр за ЦПД| на культурі клітин|клітин| Vero (клітини нирки зеленої мавпи) які, культивували на поживному середовищі 199+Ігла (1:1) з дадаванням інактивованої 10% ЕТС (Sіgma, США) і антибіотиків складав 5,0-5,5 lg ТЦД50/0,1 мл|; при інтрацеребральному| зараженні експериментальних тварин - 4-4,5 lg ЛД50/0,03 мл.  Дослідження проводили на білих безпородних мишах-самцях вагою не більше 10-12 г. розводки віварію ІМБіГ НАН. Наявність персистентної герпетичної інфекції у експериментальних тварин підтверджувалася шляхом виділення вірусу з гомогенатів внутрішніх органів та культивуванням на культурах клітин різного видового походження методом імунофлюоресценції і визначенням у сироватках крові специфічних протигерпетичних антитіл. Досліди проводились на базі лабораторії експериментальної хіміотерапії вірусних інфекцій НДІЕіІХ ім. Л.В.Громашевського, АМН України  (зав лаб. д.м.н. С.Л Рибалко.)

Вплив герпесвірусної| інфекції на активність репаративного| синтезу ДНК  досліджували на спленоцитах| мишей, виділених в градієнті фікол-верографіна (Фікол 400 фірми «Pharmacia Fine Chemicals», Швеція; верографін  - «Спофа», Чехія) в стерильних умовах.Для пригнічення реплікативного| синтезу ДНК клітини|клітини| інкубували в присутності 10 мМ| оксисечовини („Serva”, Німеччина)  протягом 30 хв. при 37° С. Потім клітини|клітини| переносили в плашки („FlowLab”, Англія) з середовищем RPMI-1640 (Sigma, США), що містило|утримує| 3Н-тимідин (ВО «Ізотоп», С.Петербург, Росія)в концентрації 10 мкКі/мл і інкубували ще 2 години при 37° С. Включення 3Н-тимідину в кислотонерозчинну| фракцію клітин|клітин| (ДНК) визначали радіометрично,осаджуючи проби  на фільтри GF/C (‘Whatman’, Англія), використовуючи напівавтоматичний прилад (Titertek, Нідерланди). Радіоактивність зразків вимірювали на базі лабораторії радіаційної імунології Центру радіаційної медицини АМН України на лічильнику „Betaplate” (LKB– Pharmacia”, Швеція). Для кількісної оцінки реакції використовували абсолютну величину включення мітки (число імпульсів за 1 хв). Інтенсивність  репаративного синтезу ДНК визначали за величиною індексу стимуляції (ІС), що є відношенням|ставленням| радіоактивності ДНК в клітинах|клітинах|, одержаних|отриманих| з|із| інфікованих тварин до такого з|із| неінфікованих [10]. 

В експериментах ізатізон вводили|запроваджували| тваринам за 24 год. до виділення спленоцитів| в дозі 100 мкг/кг маси тіла. Тварин було розподілено за такими групами: 1) контроль- інтактні тварини, 2) контроль + ізатізон, 3) тварини з персистентною герпетичною інфекцією, 4) тварини з персистентною герпетичною інфекцією + ізатізон. В кожній групі по 20 тварин. При проведенні досліджень оцінювали також здатність ізатізону стимулювати репаративну активність спленоцитів мишей з персистентною герпетичною інфекцією.

Результати досліджень

Дослідженнями з вивчення РС ДНК в спленоцитах мишей, інфікованих ВПГ, була виявлена здатність ВПГ індукувати високий рівень РС ДНК в ранні строки після інфікування -1 доба (індекс стимуляції РС ДНК через 24 год. після зараження становив    2, 29 ± 0, 1, в контролі – 1,6 ± 0,2). Проте, починаючи з 3-ї доби і далі цей ефект не спостерігається.  Збільшення активності РС ДНК в клітинах в ранній період після зараження є наслідком інтенсивної деградації клітинної|кліткової| ДНК і виникненням розривів в макромолекулах ДНК. При цьому відзначається дозозалежність впливу вірусу на величину РС ДНК. В експерименті індекс стимуляції РС ДНК в залежності від множинності зараження коливався від 2, 29 до 10,6. Індукція РС ДНК виявлялася вже починаючи з інфікуючої дози віруса 0, 001/мл і сягала максимуму при інфікуючій дозі     0,01/мл, при подальшому збільшенні дози вірусу відмічалося зниження індексу стимуляції. Отже, нами виявлена здатність|здібність| ВПГ1 індукувати РС| ДНК в процесі гострої інфекції.

З|із| літературних даних відомо, що ВПГ1 має мутагенну дію, зокрема на рівні хромосомної аберації |клітин|[11, 12]. Складність проблеми антимутагенезу при інфекційних захворюваннях і вакцинаціях полягає в тому, що наразі практично не вивчені фактори, які могли б впливати на наслідки інфекційного і поствакцинального мутагенезу. Найбільш детально зараз вивчено репаративне відновлення генетичних пошкоджень на молекулярному рівні.

У наших експериментах зараження ВПГ1 також призводило|призводило,наводило| до достовірного зростання числа аномальних мітозів| в порівнянні з контролем при одночасному зниженні мітотичного| індексу інфікованої культури (табл. 1). Останнє обумовлено придушенням синтезу клітинної|кліткової| ДНК на тлі|на фоні| зростання синтезу вірусної ДНК. Застосування|вживання| ізатізону| призводило|призводило,наводило| до пригнічення репродукції вірусу з|із| одночасним зростанням мітотичного індексу інфікованих клітин|клітин| і зниженням частоти аномальних метафаз. Тобто|цебто|, в умовах інфікування препарат діяв антимутагенно, блокуючи розмноження ВПГ1, який і виступає|вирушає| в ролі мутагенного чинника.

                                                                                                            Таблиця  1

Вплив ізатізону| і вірусу герпеса на мітотичний режим людської ембріональної тканини

Обробка  клітин|клітин|

Мітотичний

індекс, %

Аномальні мітози| %

Продукція

ВПГ1, lgТЦД50

 

Культура клітин (контроль)

   6,0+0,04

  11,1+3,0

             -

Ізатізон, 500 мкМ

дегенерація моношару

         -

            -

Ізатізон, 50 мкМ|

 

2,0+0,07**

     0

 

            -

 

Ізатізон, 5 мкМ|

4,6+0,03**

14,3+3,1

             -

ВПГ1

1,6+0,06**

25,0+5,1*

           6.5

Ізатізон, 50 мкМ| +ВПГ1

9,0+0,05**

11,2+3,0

           0.5

Ізатізон, 5 мкМ+| +ВПГ1

5,3+0,04

18,7+3,7

           1.5

Примітка.|тлумачення|... Вірогідна різниця з контролем наявна при рівні значення * p<0.01; **p<0.001.

|

Застосування ізатізону при експериментальній герпетичній інфекції викликало захисний ефект. Він| полягав у зменшенні виразності симптоматики, скороченні тривалості захворювання у гострий період інфекції, зниженні летальності мишей (табл.. 2). Загибель тварин, інфікрваних ВПГ 1 і не лікованих ізатізоном, спостерігалася в період з 7 до 11 доби і відбувалася на фоні виразних клінічних ознак захворювання. А в групах, які лікували ізатізоном, клінічні прояви хвороби були значно слабшими.

                                                                                                                        Таблиця 2

Летальність мишей, інфікованих вірусом ВПГ1, яким вводили ізатізон в різні строки

Групи експериментальних тварин

Кількість загиблих тварин в динаміці розвитку інфекції (за днями)

 

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

20 мишей, яким ввели ізатізон за 24 год. до інфікування

-

1

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

20 мишей, яким ввели ізатізон під час інфікування

-

-

-

-

-

1

1

-

2

-

1

-

20 мишей, яким ввели ізатізон через 24 год. після інфікування

-

-

-

1

-

1

1

-

-

-

-

-

20 мишей, інфікованих ВПГ1, яким не вводили ізатізон (контроль)

-

-

-

-

-

1

2

1

2

2

1

-

В спленоцитах мишей через 6 місяців після інфікування на стадії персистенції ВПГ спостерігалося стійке пригнічення системи репарації клітинної ДНК – індекс стимуляції РС ДНК  становив 0,6 - 0,7 ± 0,02.

В результаті експериментів виявлено, що ізатізон|  стимулює РС| ДНК у|в,біля| тварин з|із| персистентною| вірусною інфекцією (ІС в контролі = 1,6 ± 0,01; у присутності препарату - 3,3 ± 0,01) (р < 0,001). ( табл. 3). Індекс стимуляції РС ДНК у третій групі, яку не лікували ізатізоном, становив 0,6 ± 0,02. На підставі цього можна припустити, що препарат впливає не тільки|не лише| на перебіг гострої інфекції, але і хронічної. З проведених досліджень випливає, що ізатізон має здатність стабілізувати структуру клітинної ДНК, підвищуючи РС ДНК до рівня нормальної неінфікованої клітини.

                                                                                                                        Таблиця 3

Показники індекса стимуляції РС ДНК в різних групах  експериментальних тварин.

№ п/п

Група експериментальних тварин

Індекс стимуляції РС ДНК

1

Контроль (інтактні тварини)

1,6 ± 0,01

2

Контроль + ізатізон

1,5 ± 0,02

3

Миші з персистентною вірусною інфекцією

0,6 ± 0,02

4

Миші з персистентною вірусною інфекцією + ізатізон

 3,3 ± 0,01*

Примітка: * р < 0,001

  Діючи через систему репарації ДНК, ізатізон в експериментах значно підвищував швидкість відновлення її пошкоджених ділянок, що супроводжується менш активною репродукцією вірусу з наступною його елімінацією, та збільшенням виживання піддослідних тварин. Одержані дані дозволяють припустити, що препарат стимулює активність РС ДНК в спленоцитах, підвищуючи його до рівня інтактних тварин. Таким чином, за результатами досліджень ізатізон суттєво посилює швидкість відновлення пошкодженої ДНК, впливаючи, вочевидь, на ендогенні стимулятори репаративного синтезу і проявляє при цьому противірусну активність.

Висновки

Ізатізон має здатність модифікувати процеси репарації ДНК. Попереджує  рецидиви захворювання на ВПГ1. Проявляє антимутагенну дію при герпесвірусній інфекції. Знімає прояви клінічної симптоматики за рахунок підвищення захисних сил макроорганізму в цілому.

Література:

1. Потопальський А.І., Лозюк Л.В. Патент України №1780 Противірусний препарат ізатізон. - 1993. (Бюл. №3 от 25.10.95 )
2. Потопальский А.И., Лозюк Л.В, Миролюбова А.Н, Бесарабов Б.Ф, Противовирусный, противоопухолевый и антилейкозный препарат изатизон. Киев.: Наук. Думка.- 1991. – 192 с.
3. Лозюк Л.В., Бессарабов Б.Ф., Миролюбова А.Н., Кит В.И., Алексеенок А.Я., Погон В.Ю. Препарат изатизон и способ борьбы с  вирусными заболеваниями животных / Авт. свид. №1050151 -22.00.83
4. TarasenkoAB, VotiakovVI, MishaevaNP, ZgirovskaiaAA, ZubovichIK.\\ Theuse ofmethisazon eforpreventingviralence phalitisandencephalomyelitisinane xperimentin whitemice//Vopr.Virusol.-1990 – Vol.35, N2.- P.158-160.
5. Галегов Г.А. Химиотерапия, химиопрофилактика| вирусних инфекцийии інгибирторы| репродукции вирусов. - В кн|.: Общая|спільна| вирусология. М. - 1982. - Т.1.- С.341-362.
6. Болсунова О.І, Потягайло А. Н, Говорун Д.М., Заїка Л.А., Харченко В.М. Імуно-біологічна активність ізатізону та її зв’язок зі структурно-конформаційними особливостями молекули метисазону. – Матеріали міжнародної науково-практичного форуму „Основи молекулярно-генетичного оздоровлення людини і довкілля” Київ, - 2005.- С. 19- 21.
7. Заїка Л.А., Болсунова О.І., Потопальський А.І. Ізатізон – перспективний противірусний і протипухлинний препарат з імуномоделюючою властивістю Київ.- „Колобіг” – 2010.- 187 с.
8. Болсунова О.І., Пацковський Ю.В., Рибалко С.Л.*, Заїка Л.А., Потопальський А.І. Активність ізатізону щодо аденовірусної інфекції ін вітро //Матеріали міжнародного форуму «Основи молекулярно-генетичного оздоровлення людини і довкілля.- 2005. -  Київ –« Колобіг». С. 19 - 21.
9. Засухина Г.Д. Система вирус-клетка как модель для изучения регуляции процессами репарации и мутагенеза.- В кн.: Мутагенез и репарация в системе вирус-клетка. М.: Наука,1983, с.7-38.
10. Чумак А.А. Иммунологические методы исследования //Імун. та алергол. -1998.- №4. - С.36-37.
11. Поляк Р.Я,, Дубровина Т.Я., Леонтьева Г.Ф. Молекулярные и клеточныые  основы противовирусной защиты \\ Итоги науки и техники./Иммунология. -1986.-Т.17.- C.147-176.
12. Степанчук В.А., Патока В.В., Рубан В.І., Шаповал В.В. Імунобіологічні аспекти проблеми профілактики та лікування герпетичної інфекції // Герпесвірусні інфекції – клініка, лікування, діагоностика / Науково-практична конференція. -15-16 жовтня  Київ.- 2002 р.- С. 22-23.

nbsp;width:144px;nbsp;width:313px;1nbsp;

0
Ваша оценка: Нет
Комментарии: 0
Партнеры
 
 
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
Would you like to know all the news about GISAP project and be up to date of all news from GISAP? Register for free news right now and you will be receiving them on your e-mail right away as soon as they are published on GISAP portal.