facebook
twitter
vk
instagram
linkedin
google+
tumblr
akademia
youtube
skype
mendeley
Wiki
Global international scientific
analytical project
GISAP
GISAP logotip
Перевод страницы
 

ОСОБЕННОСТИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И УРОВЕНЬ GDF 15 В КОСТНОМ МОЗГЕ У ПАЦИЕНТОВ С БОЛЬШОЙ ТАЛАССЕМИЕЙ

ОСОБЕННОСТИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И УРОВЕНЬ GDF 15 В КОСТНОМ МОЗГЕ У ПАЦИЕНТОВ С БОЛЬШОЙ ТАЛАССЕМИЕЙ
Ali Guliyev, pediatrist

HB Guven Clinic, Azerbaijan

Duygu Uckan Cetinkaya, заведующий отделом, доктор медицинских наук, профессор

Hacettepe University, Турция

Участник конференции

Мезенхимальные стволовые клетки, являясь важным компонентом микроокружения костного мозга и играя активную роль в случае неэффективного эритропоэза, при необходимости участвуют в регуляции эритропоэза путем синтеза цитокинов.В этом исследовании был изучен  иммунофенотипирование, проточная цитометрия, культивирование и дифференциация мезенхимальных стволовых клеток (остеогенная и адипогенная) и с помощью надосадочной взвеси культуры мезенхимальных стволовых клеток в плазме костного мозга был определен уровень фактора GDF15, предполагаемого регулятора эритропоэза.

Ключевые слова: Талаcсемия, мезенхимальные стволовые клетки, GDF15

Mesenchymal stem cell (MSC)’s are the important component of the microenvironment of the bone marrow and in ineffectiv eritropoesis plays an important role in the synthesis of  cytokines. In the present study  proliferative characteristics, morphology, phenotype and differentiation capacity of MSC s were examined. In addition, culture supernatants and bone marrow plasmas were analyzed for GDF 15.

 Keywords: Thalassemia, mesenchymal stem cells, GDF 15

Талассемии являются самым частым генетическим гематологическим заболеванием в мире.Передаваясь аутосомно-рецессивным путем, гетерозиготная форма талассемии проявляется носительством этого заболевания, а гомозиготная форма-хронической гемолитической анемией. В результате повторяющихся гемотрансфузий у больных талассемией увеличивается количество железа в организме.1

В организме человека основным регулятором метаболизма железа является молекула гепсидина. Гепсидин - это пептидный гормон, большей частью синтезируемый печенью, циркулирующий в кровии выделяемый почками. Гепсидин уменьшает всасывание железа в тонком кишечнике,тормозит выход железа из макрофагов,поглотивших старые эритроциты, в плазму и препятствует мобилизации железа из его депо в печени.Вопреки тому, что гепсидин, являясьосновным регулятором метаболизма железа,препятствует поступлению железа в организм и его высвобождению из макрофагов,при талассемии и других видах анемий, протекающих с неэффективным эритропоэзом, высокий уровень железа и низкий уровень гепсидина наталкивает на мысль о наличии других механизмов регуляции.Обнаружение в случае врожденных дисэритропоэтических анемий, талассемий и других заболеваний, протекающих с неэффективным эритропоэзом,  высоких значений growth differentiation factor 15 (GDF 15), относящегося к семейству  TGF-?(transforming growth factor) и играющего важную роль в делении, дифференциации и регенерации тканей, позволяет предположить  его возможную роль в эритропоэзе и  метаболизме железа.2,3  Подавление GDF 15 синтеза гепсидина дает возможность предположить о наличии связи между этой молекулой и эритропоэзом и возможном взаимодействии с клетками микроокружения костного мозга.4

Известно, что микроокружение костного мозга влияет на образование полноценных клеток крови из гематопоэтических стволовых клеток. Известно,что мезенхимальные стволовые клетки, являющиеся основным компонентом микроокружения, могут дифференцироваться в поддерживающие клетки во главе с остеобластами и адипоцитами,обеспечивая стромальную поддержку гематопоэтическим клеткам, а также способны регулировать дифференциацию и деление гематопоэтических клеток.Мезенхимальные стволовые клетки оказывают влияние на гематопоэтические клетки путемвзаимодействияклетка-клетка, клетка-матрикс,атакже посредством секреторныхфакторов, продуцируемых  мезенхимальнымистволовымиклетками.5

В этом исследовании было предположено наличие значительных изменений в микроокружении костного мозга у пациентов с большой талассемией и другими заболеваниями,протекающими с неэффективным эритропоэзом, и была поставлена цель изучить физические, антигенные, секреторные особенности и особенности дифференциации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга. Также была поставлена цель наряду с исследованием мезенхимальных стволовых клеток изучить их секреторные факторы, особенно GDF-15, у пациентов с большой талассемией,перенесших трансплантацию гематопоэтических стволовых клеток, до и после трансплантации.

Для осуществления этого исследования было получено разрешение соответствующих  комиссий по этике. (Комиссия по этике № FON 09/33-198).  Исследование было поддержано отделом научных исследований медицинского факультета Университета Хаджеттепе (Проект № 5014)

Mатериалы и методы

В этом исследовании был изучен костный мозг 10 пациентовс большой талассемиейдо трансплантации гематопоэтических стволовых клеток.Был сравнен костный мозг 6 пациентов после трансплантации с контрольной группой,состоящей из костного мозга 8 здоровых доноров.   После разморозки замороженного костного мозга были проведены иммунофенотипирование, проточная цитометрия и культивирование мезенхимальных стволовых клеток.Кроме того,была исследована дифференциация мезенхимальных стволовых клеток (остеогенная и адипогенная) и с помощью надосадочной взвеси культуры мезенхимальных стволовых клеток в плазме костного мозга был определен уровень фактора GDF15, предполагаемого регулятора эритропоэза. 

Изоляция мезенхимальных стволовых клеток и их размножение в культуре:

Изъятые образцы костного мозга были распределены по стерильным пробиркам и центрифугированы в течении 10 минут при 2300 об/мин. После определенных манипуляций в пробирки объемом 75 см 3 были посажены клетки для роста и  для получения  4x103 клеток /cm.2

На этом рисунке отражено размножение клеток до 3 пассажей.6

                                                                                A                                                                               B

           Рисунок 1. Вид мезенхимальных стволовых клеток, размножающихся в среде,при  рассмотрении в инвертированный микроскоп. (случай 2) (А:увеличение в 4 раза, В:увеличение в 10 раз)

Иммунное фенотипирование мезенхимальных стволовых клеток
(исследование проведено с помощью проточной цитометрии)
:

Клетки, изолированные из костного мозга человека, были идентифицированы с помощью антител в аппарате проточной цитометрии6 и проанализированы с помощью аппарата проточной цитометрии FACS Aria (BD Biosciences, USA)

 Оценка способности мезенхимальных стволовых клеток к дифференциации:

Для оценки адипогенной и остеогенной способности к дифференциации  мезенхимальных стволовых клеток в культуру клеток были добавлены соответствующие стимуляторы.  Стимулированные к дифференциации клетки были гистохимически окрашены и морфологически изучены.

   

                                                                                  A                                                                            B

Рисунок 2.Образование в последующие дни в мезенхимальных стволовых клетках, стимулированных в адипогенной среде, круглых жировых капель и их положительная окраска  красителем Oil Red O (A: адипогенные клетки,не покрашенные Oil Red O.  10x, B: адипогенные клетки, покрашенные Oil Red O).

Исследование плазмы костного мозга и  надосадочной взвеси культур с помощью метода EL?SA:

Образцы  надосадочной взвеси культур мезенхимальных стволовых клеток, изъятые у доноров и реципиентов до и после трансплантации костного мозга и плазма костного мозга этих образцов были  исследованы с помощью Duo-Set Enzym-linked immunosorbent assay (EL?SA), специально разработанного для изучения фактора роста и дифференциации GDF 15.

Обсуждение

Мезенхимальные стволовые клетки играют важную роль в захвате стромой гематопоэтических стволовых клеток (экстрацеллюлярным матриксом и стромальными клетками), дифференциации предшественников гематопоэтических клеток в зрелые клетки под влиянием различных секреторных факторов, образование резерва стволовых клеток вследствии ингибирования путем задержки развития стволовых клеток в фазе G0 клеточного цикла,самообновление или мобилизация, миграция  в другие ткани при необходимости.7,8 Предполагается, что исследование мезенхимальных стволовых клеток костного мозга при  различных заболеваниях кроветворной системы поможет обнаружить механизмы регуляции и обеспечения нормального гематопоэза.   Наряду с возросшим интересом к мезенхимальным стволовым клеткам, подавляющее большинство исследований проводится с образцами мезенхимальных стволовых клеток здоровых испытуемых и изъятыхиз различных областей.С другой стороны наличие такой патологии гематопоэтических клеток, как большая талассемия, навело на мысль о наличии возможных компенсаторных/ адаптивных изменений в мезенхимальных стволовых клетках,являющихся компонентами микроокружения костного мозга, исследование которых приведет к лучшему пониманию мезанизмов развития патологии крови.   

В нашем исследовании были изучены мезенхимальные стволовые клетки костного мозга пациентов, перенесших трансплантацию гематопоэтических стволовых клеток по поводу талассемии мажор, а также сопоставлены результаты с контрольной группой, состоящей из здоровых пациентов. При сравнении результатов морфологического, иммунофенотипического исследований, осуществленных для характеризациимезенхимальных стволовых клеток, а также ихспособности к дифференциации в адипоциты и остеокласты  с результатами нормальныхконтрольныхобразцовне было обнаружено значительных различий.В образцах, изъятых у 3 пациентов, наше внимание привлекло образование эритроидной колонии на поверхности мезенхимальных стволовых клеток, и,по крайней мере до конца пассажа 0, отмечалась их жизнеспособность,из чего был сделан вывод о том,что мезенхимальные стволовые клетки оказывают стромальную поддерживающую функцию эритропоэтическим клеткам.    

Зная особенности синтезирования  растворимого фактора, являющегося однимиз важнейших особенностей мезенхимальных стволовых клеток,как поддерживающей ткани, ипредполагая как наличиевозможныхразличиймежду  пациентами с талассемией мажор и контрольной группой, так и лучшее отражение адаптационных изменений,в исследовании был изучен уровень  GDF 15- одного из веществ,влияющих на эритропоэз и метаболиз железа.  Желая отразить микроокружение костного мозга, этот фактор был изучен в плазме костного мозга, кроме того, с целью выяснения роли мезенхимальных стволовых клеток, была использована надосадочная взвесь культур клеток.

Исследования, проведенные в последние годы, подтвердили важную роль  гепсидина и  GDF 15в метаболизме железа. Предполагая высокий уровень этого вещества при неэффективном эритропоэзе-состоянии, сопровождающимся высокими значениями депо железа, мы столкнулись с полной противоположностью.

В результате наше внимание сосредоточилось на других возможных механизмах, играющих роль в метаболизме железа.GDF 15 является одним из представителей в-семейства TGF. Обладает сходством на 15-29% с другими представителями этого семейства,но дает повод предположить наличие возможной отличной, присущей только этому веществу, роли.GDF 15 ингибирует позднюю фазу активации макрофагов, ингибирует пролиферацию незрелых предшественников гематопоэза, препятствует росту различных опухолей, оказывает антиангиогенное действие, участвует в эмбриогенезе,остеогенезе и гематопоэзе.10  Наряду с тем,что GDF 15синтезируется многими тканями в литературе нет данных о том,что является источником этого вещества при состояниях,сопровождающихся неэффективным эритропоэзом.

Вэтом исследовании, учитывая его возможное влияние на эритропоэз и ингибирование синтеза гепсидина, был изучен уровень GDF 15в плазме костного мозга и надосадочной взвеси культуры мезенхимальных стволовых клеток.

Танно с коллегами в результате своихисследований  в 2007 году обнаружили в сыворотке пациентовбольшой талассемией высокий уровень GDF 15.В образцах сывороток этих же пациентов былио бнаружены, наряду с высоким уровнем GDF15, высокие уровни ферритина, эритропоэтина, растворимых рецепторов трансферрина,одновременное подавление экспрессии мРНК гепсидинавгепатоцитах пациентов с большой талассемией, обнаружено предотвращение супрессии гепсидина путем снижения уровня GDF 15. В результате, наше внимание привлекло влияние GDF 15 на метаболизм железа и особенно на подавление синтеза гепсидина.11

И вновь Рамирез с коллегами у пациентов с РАРС12, Финкенштед и товарищи у пациентов с недостаточностью пируваткиназы13, Тамари и соратники у пациентов с врожденной дисэритропоэтической анемией типа1 обнаружили высокий уровень GDF 15. Был проанализирован уровень GDF 15в сыворотки и костном мозге при заболеваниях, протекающих с неэффективным эритропоэзом, но в литературе не было обнаружено сведений об исследовании синтеза GDF 15мезенхимальными стволовыми клетками микроокружения в состоянии неэффективного эритропоэза.

В исследованиипри сравнении с контрольной группой были обнаружены более высокие значения GDF 15 в плазмекостного мозгаупациентов с большой талассемией. При исследовании надосадочной взвеси культур мезенхимальных стволовых клетокбыло обнаружено, чтопри полном отсутствии GDF 15вконтрольной группе, у некоторых пациентов в экспериментальной группе наблюдался высокий уровень GDF 15. В образцах пассажа 0, в которых были обнаружены эритроидные колонии, в 4 из 6 случаевбыл обнаружен высокий уровень GDF 15, что натолкнуло на мысль о том,что имеет место его синтез предшественниками эритроидного ряда.Выявление высокого уровня GDF 15 в надосадочной взвеси культур мезенхимальных стволовых клеток у некоторых пациентовнатолкнуло на мысль об контролировании этого уровня функциями микроокружения костного мозга. Поддерживание мезенхимальными стволовыми клетками количества GDF 15 на определенном уровне может говорить об ингибирующей или стимулирующей функции.  GDF 15 приводит к значительному снижению уровня гепсидина,тем самым способствуя накоплению железа в организме11. Накопленное избыточное количество железа, наряду с нарушением функций паренхиматозных органов, также приводит к нарушению функционирования микроокружения костного мозга.Вэтом случае предполагается, что мезенхимальные стволовые клетки, являющиеся важным компонентом микроокружения костного мозга, играют определенную роль в регуляции уровня GDF 15с целью протекции себя и окружения от этого патологического накопления.

Для осуществления нормального эритропоэза необходим GDF 15.В одном из

Среднее: 79.9±46.3      Среднее: 1745.2±1286.8       Среднее: 1183.9±1138

Tаблица1. Уровни GDF 15 в плазме костного мозга. А: контрольная группа, В: до трансплантации гематопоэтических стволовых клеток, С: после трансплантации гематопоэтических стволовых клеток. ( Случай 8а:1. трансплантации гематопоэтических стволовых клеток, случай 8б: 2. трансплантации гематопоэтических стволовых клеток,)

проведенных исследований былопоказано,что вслед за снижением уровня GDF 15 наблюдалось снижение нормальной дифференциации эритроидных  предшественников12.В случае неэффективного эритропоэза значительное увеличение уровня GDF 15 говорит об снижении чувствительности предшественников эритропоэза к GDF 15 или об попытке задержать усиленный апоптоз, наблюдающийся в этом случае.В зависимости от вида неэффективного эритропоэза,в случае необходимостимезенхимальные стволовые клетки также могут принимать участие в синтезе GDF 15.  Высокий уровень GDF 15 в надосадочной взвеси культур мезенхимальных стволовых клетоку части исследуемых пациентов можно связать с этим предположением.  В нормальном костном мозге при наличии физиологических условий содержится незначительное количество GDF 1512 . Внормальных условиях это незначительное количество GDF 15поддерживается мезенхимальными стволовыми клетками, а при наличии патологических процессов- предшественниками эритроидного ряда.

В итоге предполагается,что мезенхимальные стволовые клетки,являясь важным компонентом микроокружения костного мозга и играя активную роль в случае неэффективного эритропоэза,при необходимости участвуют в регуляции эритропоэза путем синтеза цитокинов. С этой точки зрения высокий уровень  GDF 15 в надосадочной взвеси культуры мезенхимальных стволовых клеток у некоторых пациентов с большой талассемиейдо и после трансплантации гематопоэтических стволовых клеток говорит об обеспечении и осуществлении нормального эритропоэза. Наряду с этим очевидна необходимость в большем количестве исследований. 

Литература:

  1. Olivieri NF. The ? thalassemias. N Engl J Med. 1999;341:99-109.
  2. Ramirez JM, Schaad O, Durual S, et al. Growth differentiation factor 15 is necessary for normal erythroid differentiation and is increased in refractory anaemia with ring-sideroblasts. Br J Haematol 2009;144:251-62.
  3. Finkenstedt A, Bianchi P, Theurl I, et al. Regulation of iron metabolism through GDF 15 and hepcidin in pyruvate kinase deficiency. Br J Haematol  2009;144:789-93
  4. Dallalio G, Law E, Means RT Jr.Hepcidin inhibits in vitro erythroid colony formation at reduced erythropoietin concentrations.Blood 2006;107:2702-4
  5. Aerts F, Wagemaker G. Mesenchymal stem cell engineering and transplantation. In: JA Notla (ed) Genetic engineering of mesenchymal stem cells, Kluwer Academic Publishers. 2004:pp 1-39.
  6. U?kan D, Kilic E, Sharafi P, et al. Adipocyte differentiation defect in mesenchymal stem cells of patients with malignant infantile osteopetrozis. Cytotherapy 2009;11:392-402
  7. Wilson A, Trumpp A. Bone-marrow haematopoietic-stem-cell niches. Nat Rev Immunol  2006;6:93-106.
  8. Kassem M, Kristiansen M, Abdallah BM. Mesenchymal stem cells: cell biology and potential use in therapy. Basic Clin Pharmacol Toxicol  2004;95:209-14.
  9. Lee PL, Beuter E. Regulation of hepcidin and iron-overload disease. Annu Rev Pathol  2009;4:489-515.
  10. Lakhal S, Talbot NP, Craosby A, et al. Regulation of growth differentiation factor 15 expression by intracellular iron. Blood  2009;113:1555-63.
  11. Babitt JL, Huang FW, Xia Y, et al. Modulation of bone morphogenetic protein signaling in vivo regulates systemic iron balance. J Clin Invest 2007;117:1933-9.
  12. Wang RH, Li C, Xu X, et al. A role of SMAD4 in iron metabolism through the positive regulation of hepcidin expression. Cell Metab  2005;2:399-409.
  13. Tanno T, Bhanu NV, Oneal PA, et al. High levels of GDF 15 in thalassemia suppress expression of the iron regulatory protein hepcidin. Nat Med  2007;13:1096-101.
Комментарии: 0
Партнеры
 
 
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
Would you like to know all the news about GISAP project and be up to date of all news from GISAP? Register for free news right now and you will be receiving them on your e-mail right away as soon as they are published on GISAP portal.