facebook
twitter
vk
instagram
linkedin
google+
tumblr
akademia
youtube
skype
mendeley
Global international scientific
analytical project
GISAP
GISAP logotip
Перевод страницы
 

ПРОДУКТЫ АЛКИЛИРОВАНИЯ ТИОТЭФОМ КОМПОНЕНТОВ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ / PRODUCTS OF ALKYLATION OF COMPONENTS OF NUCLEIC ACIDS BY THIOTEPA AND THEIR BIOLOGICAL EFFECTS

ПРОДУКТЫ АЛКИЛИРОВАНИЯ ТИОТЭФОМ КОМПОНЕНТОВ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И ИХ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ЭФФЕКТ / PRODUCTS OF ALKYLATION OF COMPONENTS OF NUCLEIC ACIDS BY THIOTEPA AND THEIR BIOLOGICAL EFFECTS
Тамара Волощук, старший научный сотрудник, кандидат химических наук

Воробьева Ирина, инженер

Институт оздоровления и возрождения народов Украины, Украина

Потопальский Анатолий, кандидат медицинских наук, доцент

Национальная академия наук Украины - Институт молекулярной биологии и генетики, Украина

Участник конференции

Раздел: Препараты нуклеиновых кислот, их фундаментальное и практическое значение.

Представлены результаты работы по алкилированию компонентов нуклеиновых кислот двумя монофункциональными алкилирующими агентами (этиленимином и моноэтилениминдиэтилфосфатом) и трифункциональным агентом – триэтиленимином тиофосфорной кислоты (тиотэфом). Монофункциональные агенты использованы для установления структуры продуктов алкилирования тиотэфом. Показано, что при алкилировании тиотэфом образуются четыре продукта с различными алкильными радикалами (приведены их структуры) с разной степенью размыкания этилениминных циклов. Показано, что более высоким противоопухолевым эффектом обладают ДНК, алкилированные тиотэфом с двумя или одним неразомкнутым этилениминным циклом, благодаря чему тиотэф может сшивать двойные цепи ДНК, нарушая тем самым ее функции.

Ключевые слова: тиотэф, нуклеиновые кислоты, алкилирование, свободные основания, противоопухолевая активность

The results of the research on the alkylation of components of nucleic acids using two monofunctional alkylating agents (ethyleneimine and monoetilenimindiethylphosphate) and threefunctional agent – triethylenimine thiophosphoric acid (Thiotepa) presented. Monofunctional agents used to establish the structure of Thiotepa alkylation products. It is shown, that during the alkylation using Thiotepa, four products with different alkyl radicals (their structures are given) with varying degrees of opening of ethyleneimine cycles are produced. Shown that DNA alkylated using Thiotepa with one or two not-opened ethyleneimine cycles has a higher antitumor effect, due to that Thiotepa can sew the double DNA strands, thereby disrupting its function.

Keywords: Thiotepa, nucleic acids, alkylation, free bases, antitumor activity

 

Борьба с злокачественными новообразованиями ведется в основном двумя путями: лекарственными растениями, в частности чистотелом, и методами официальной медицины – химическими препаратами, в том числе трифункциональным алкилирующим агентом – триэтиленимином тиофосфорной кислоты (тиотэф). Лечение чистотелом может замедлить рост опухоли, но не дает полного излечения. Тиотэф, напротив, излечивает опухоль, но будучи очень токсичным, приводит к заболеваниям крови, которые обычно заканчиваются летально. Поэтому представлялось целесообразным получить различные продукты, используя положительные качества тех и других. А.И. Потопальским открыто и все эти годы разрабатывается новое научное направление целенаправленного улучшения структуры природных биологически активных веществ с получением препаратов, которые на молекулярном и генетическом уровнях оздоравливают человека и окружающую среду [1]. Используя в качестве алкилирующего агента тиотэф на основе природних биологически активных веществ были получены различные препараты, обладающие противоопухолевыми, иммуномодулирующими, противовирусными средствами [1-5].

Перед нами стояла задача установить строение полученных препаратов для понимания механизма их действия. С этой целью в качестве алкилирующих агентов кроме тиотэфа были использованы монофункциональные алкилирующие агенты с одним азиридиновым циклом (этиленимин, ЭИ) и моноэтиленимин диэтилфосфат (МЭФ):

 

Для этого было проведено алкилирование как ДНК, так и отдельных ее компонентов: свободных азотистих оснований, нуклеозидов, нуклеотидов. [6-9]. Lawley P.D. с соавторами показали, что электрофильные алкилирующие агенты обладают мутагенным и канцерогенным действием, а ди- и полифункциональные соединения могут оказывать еще и противоопухолевый эффект благодаря способности сшивать двойные цепи молекул ДНК [10]. К последним относятся использованные нами МЭФ и Тиотэф. Ранее в работах, посвященных изучению реакций алкилирования тиотэфом и другими производными этиленимина на основе алкилирования метилированных оснований делался вывод о принципиальной возможности алкилирования всех оснований в составе ДНК [11-14].

В качестве основного объекта для установления строения получаемых продуктов алкилирования был выбран аденин – одно из главных свободных азотистых оснований НК.

Аденин

Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в обращенной фазе реакционная смесь разделилась на 4 фракции, отличающиеся по времени удерживания на колонке. С помощью кислотного гидролиза фракций выделены свободные основания, алкилированные по разным атомам азота аденина. Идентификацию сайта алкилирования осуществляли путем измерения их спектров поглощения и других спектральных характеристик (Табл. 1) с последующим сравнением последних с аналогичными показателями продуктов алкилирования аденина другими алкилирующими агентами [15]. Singer B. было установлено, что природа алкилирующего агента не имеет влияния на спектр поглощения и другие характеристики модифицированного основания, а определяются исключительно положением модифицируемого азота в цикле основания.

 

Таблица 1.

Спектральные характеристики алкилированных аденинов, выделенных методом обращено-фазовой ВЭЖХ

Направление алкилирования

рН

max – min, нм*

pKa [15 Вол-1]

А

Б

N1

1

263-235

262-233

7,2

12

272-246

271-242

N3

1

276-233

275-236

(5,1), 6,0-6,5

12

274-245

274-245

N9

1

259-228

258-227

4,0

12

263-234

261-229

N6

1

272-233

272-234

3,7-4,2

12

273-244

273-236

Аденин

1

 

262,5-229

4,15

12

 

269,5-237

 

* А – наши данные, алкилирующие агенты – тиотэф, ЭИ, МЭФ

 Б – данные обзора [15 Вол-1], алкилирующие агенты – азотистый и сернистый иприты, окись этилена.

Аналогичные реакции были проведены для других оснований НК. Гуанин алкилируется в основном по положению N9 и N7 и в меньшей мере по положению N1. Как и в случае аденина, спектры поглощения алкилпроизводных гуанина в ультрафиолете оказались практически одинаковыми для всех алкилирующих агентов (ЭИ, МЭФ, тиотэф). Пиримидиновые основания алкилируются значительно медленнее и с очень небольшим выходом (до 1%) в основном по положению N3, а цитозин – еще и по N4 (Табл. 2)

Таблица 2.

Спектральные характеристики продуктов алкилирования тиотэфом гуанина, урацила и цитозина

Направление алкилирования

рН

max – min, нм*

А

Б

Гуанин

N1

1

253(272)-233

251(274)-229

12

277(261)-246

278(260)-243

N7

1

252(272)-232

249(272)-233

12

283-257

280-258

N7*

1

262-230

262-221

12

260-248

261-243

N9

1

253(277)-231

251(276)-

12

256(269)-241

258(268)-

Урацил

N3

1

262-235

259-230

12

281,5-248

218,283-245

Цитозин

N3

1

277-246

275-242

12

297-258

294-254

N4

1

280-248

277-244

12

289-259

284-253

 

* А – наши данные, алкилирующие агенты – тиотэф, ЭИ, МЭФ

 Б – данные обзора [15 Вол-1], алкилирующие агенты – азотистый и сернистый иприты, окись этилена.

При алкилировании агентами, содержащими этилениминную группу, происходит расщепление цикла через образование промежуточной частицы иммониевого катиона (Im+) с образованием различных радикалов.

Схема 1

 

В случае алкилирования этиленимином образуется аминоэтильный радикал -CH2-CH2-NH2 , далее в схемах радикал R.

В случае алкилирования МЭФ в разультате раскрытия этилениминного цикла образуются продукты фосфаминоэтилирования, в случае гидролиза PN связи образуется продукт аминоэтилирования (R) и продукт гидролиза МЭФ.

Схема 2

Тиотэф благодаря высокому значению pKa (7,8) [16] может алкилировать в нейтральных средах, но алкилирование идет медленно. Реакции ускоряются в присутствии донора протонов, в качестве которого мы применяли хлорную кислоту [6].

При помощи перечисленных выше алкилирующих агентов (ЭИ и МЭФ) установлено, что для тиотэфа, имеющего три фосфамидные связи, можно предположить четыре типа алкильных радикалов (R1, R2, R3, R). Радикал R при алкилировании тиотэфом образуется при расщеплении PN связи радикала R3. Соответственно образуется четыре типа продуктов алкилирования по одному и тому же положению в результате последовательного расщепления трех амидных связей [15]. Строение радикалов должно иметь вид:

Схема 3

В полинуклеотидах алкилироваться могут только концевые фосфаты, имеющие структуру дианиона, и нуклеиновые основания [17].

Наиболее активным центром алкилирования в НК является положение N7 гуанинового основания, по которому обычно образуются сшивки молекул. Этим объясняется более высокая противоопухолевая активность алкилированных НК по сравнению с активностью модифицированных мономерных компонентов [9].

В дальнейшем полученные продукты были исследованы на их противоопухолевую активность. Был изучен биологический эффект алкилированных титэфом молекул ДНК и ее мономерных компонентов с учетом строения радикалов разной степени алкилирования (R1 – R3).

Предположив, что противоопухолевое действие алкилированных препаратов может быть связано с нарушением нуклеинового обмена в клетках, мы изучили влияние алкилированных препаратов на синтез РНК и ДНК через включение опухолевыми клетками соответствующих меченых предшественников этих кислот – уридина и тимидина. В опытах invitroна клетках асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) препарат алкилированной тиотэфом ДНК (ДНТ) более чем на 50 % ингибировал включение экзогенного тимидина в ДНК опухолевых клеток и гораздо меньше влиял на включение уридина. Препараты нативных ДНК и тиотэф (в концентрации до 0,5 мМ) указанным эффектом не обладали. Увеличение концентрации тиотэфа до 1,5мМ подавляло процесс включения экзогенного тимидина в ДНК опухолевых клеток [18].

Большинство модифицированных мономерных компонентов НК обладают сходным с ДНТ, но менее выраженным биологическим эффектом. Сопоставимый с ДНТ эффект достигается ими при увеличенном почти втрое времени инкубации. Наиболее полно изучено влияние аденина, алкилированного по трем положениям гетероцикла радикалами Rи R1. Радикал R в аденине во всех трех положениях (N1, N3, N9) практически не влиял на процесс включения нуклеозидов в НК клеток (87-97% включения) Для радикала R1, напротив, выявлена значительная степень угнетения включения, причем сайт алкилирования здесь также важен. Эффективность алкилирования оснований увеличивается в ряду замещения по N9<N3<N1 положениям (соответственно » 74, 56 и 40% включения тимидина). Не менее действенным в отношении угнетения включения опухолевыми клетками обоих нуклеозидов оказался и соответствующий нуклеозид N1 замещенный аденозин (37 и 56% включения тимидина и уридина соответственно)

В результате исследования установлено, что АМР (аденозинмонофосфат), изночально обладающий ингибирующим действием (около 50%) на включение уридина, после алкилирования теряет эту способность. В то же время немодифицированный гуаниновый нуклеотид (GMP), наоборот, будучи стимулятором синтеза обеих НК опухолевых клеток, после алкилирования изменяет направленность своего действия, значительно снижая процент включения нуклеозидов. По-видомому, именно этим объясняется более высокая противоопухолевая активность ДНТ, алкилированных в осном по N7 по сравнению с таковой для алкилированных компонентов НК.

Результаты экспериментов на клетках другой опухоли – асцитной гепатомы Зайдела (АГЗ)– оказались аналогичными опытам на АКЭ. Скорость включения тимидина в контроле и в присутствии тиотэфа такая же, как и для уридина, но для клеток, обработанных разными ДНК, она так же варьирует: нативные ДНК оказывают слабый стимулирующий эффект, а ДНТ – достаточно выраженный ингибирующий. То есть на клетках АГЗ просматривается тот же эффект преимущественного торможения синтеза ДНК опухолевых клеток [18].

Таким образом, нами установлено, что алкилированные тиотэфом препараты преимущественно тормозят синтез ДНК опухолевых клеток карциномы Эрлиха и гепатомы Зайдела и гораздо меньше влияют на синтез РНК. Более эффективными оказались препараты, несущие нераскрытые азиридиновые циклы, которые образуются при алкилировании в нейтральных средах, когда алкилирование протекает медленнее, чем в кислых средах, вызывающих гидролиз азиридиновых циклов и PN-связей.

 

Литература:

  • 1. Потопальский А.И. Некоторые данные о лечении злокачественных опухолей в эксперименте // В кн.: XXXI конференцiя наукового студентсько­го товариства Станiславського медiнституту, Станiслав. 1961. -С.36-37
  • 2. Потопальский А.И., Пет­личная Л.И, Ивасивка С.В. "Модификация алкалоида берберина" -Киев: "Наукова думка", 1980. -109с.
  • 3. Потопаль­ский А.И., Петличная Л.И., Ивасивка С.В. "Барбарис и его препараты в биологии и медицине" –Киев: "Наукова думка", 1989. -287с.
  • 4. Потопальский А.И. "Препараты чистотела в биологии и медицине" –Киев: "Наукова думка", 1992. -200 с.
  • 5. Potopalsky A., Bolsunova O., Zaika L. New methods for molecular genetic recovery of humans and environment - Saarbrücken: LAPLAMBERT Academic Publishing, 2014. -  123р.
  • 6.  Voloshchuk T.P., Patskovskii Yu.V., Potopal'skii A.I. Alkylation of nucleic acid components by ethyleneimine. 1. Alkylation of bases. // Bioorganic Chemistry, Moskou, 1990, vol. 16, pp. No 7. 981-990. Russian New-York. 1991, V.16, No 7. рр. 549-557
  • 7. Voloshchuk T.P., Patskovskii Yu.V., Potopal'skii A.I. Alkylation of the components of nucleic acids by ethyleneimine and its derivatives. 2. Alkylation of nucleosides // Bioorganic Chemistry, Moskou, 1993, vol.19. No 4. pp. 484-493. Russian New-York. 1993, V.19. No 4. pp. 241-247
  • 8. Voloshchuk T.P., Patskovskii Yu.V., Potopal'skii A.I. Alkylation of the components of nucleic acids by ethyleneimine and its derivatives. 3. Alkylation of nucleotides // Bioorganic Chemistry, Moskou, 1993, vol.19. No 5. pp. 562-569. Russian New-York. 1993, V.19, No 5. pp.297-303
  • 9. Voloshchuk T.P., Patskovskii Yu.V., Potopal'skii A.I. Alkylation of nucleic acid components by ethyleneimine. 4. Alkylation of homo-polynucleotides and DNA // Bioorganic Chemistry, Moskou, 1999, vol.25, No 6. pp. 464-473. Russian New-York. 1999, vol.25, No 6. pp. 464-473.
  • 10. Lawley P.D., Brookes P. Alkylation of Nucleic acid their consistent nucleotides. // Biochem. J. 1963, V. 89, pp. 127-138.
  • 11. Hemminki K.// Chem.-Biol. Inter. 1984. V. 48. № 3. P. 249—260.
  • 12. Серебряный А.М., Андриевский Г.В., Беккер А.Р., Сибельдина Л.А ., Ша­рова О.Л. Строение продуктов модификации нуклеотидов и ДНК этиленимином и тиотэфом. // Биоорган, химии. 1987. Т.13. № 6. С. 786—792.
  • 13. Суходуб Л.Ф., Шелковский В.С., Косевич М.В., Пятигорская Т.Л., Жилко­ва О.Ю. // Докл. АН СССР. 1985. Т.283. № 3. С. 714—716.
  • 14. Серебряный А .М., Андриевский Г.В., Беккер А.Р., Сибельдина Л.А., Поволоцкая М.И. Направления алкилирования дезоксигуанозина и дезоксигуанозинмонофосфорной кислоты тиотэфом. // Биооргаи. химия. 1986. Т. 12. № 4. С. 499—506.
  • 15. Singer B. The Chemical Effects of Nucleic Acid Alkylation and Their Relation to Mutagenesis and Carcinogenesis // Progr. in Nucl. Acides Res. and Mol. Biol.. V.15 / Ed. Cohn. W.E.N.Y.: Acad. Press, 1975. P.219 – 280.
  • 16. Лидак М.Ю., Гиллер С.А., Медне А.Я. ТиоТЕФА. -Рига: Изд. АН Латв ССР, 1961. С. 5-8
  • 17. Пацковский Ю.В., Волощук Т.П., Потопальский А.И. Некоторые особенности реакции полинуклеотидов с тиофосфамидом // Биополимеры и клетка, 1989. Т5. №5. С.64-70
  • 18.  Voloshchuk T.P., Patskovsky Yu.V., Potopalsky A.I., Vorobyeva I.I. Effect of thioTEPA modified DNA forms and their monomeric components of varying alkylation degree on synthesis of nucleic acids in tumor cells // Biopolym. Cell -2003. –Vol.19. –N.6. –P.513-519 
Комментарии: 1

Кацан Валентина Андреевна

Очень интересная работа, скорее всего, не имеющая аналогов в мировой науке.
Комментарии: 1

Кацан Валентина Андреевна

Очень интересная работа, скорее всего, не имеющая аналогов в мировой науке.
Партнеры
 
 
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
Would you like to know all the news about GISAP project and be up to date of all news from GISAP? Register for free news right now and you will be receiving them on your e-mail right away as soon as they are published on GISAP portal.