facebook
twitter
vk
instagram
linkedin
google+
tumblr
akademia
youtube
skype
mendeley
Global international scientific
analytical project
GISAP
GISAP logotip
Перевод страницы
 

АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ КАК ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МЕТОД В ИССЛЕДОВАНИИ ПЛОТНЫХ ТКАНЕЙ

АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ КАК ДОПОЛНИТЕЛЬНЫЙ МЕТОД В ИССЛЕДОВАНИИ ПЛОТНЫХ ТКАНЕЙ
Cергей Московский

Конев Владимир Павлович, заведующий кафедрой, доктор медицинских наук, профессор

Шестель Игорь Леонидович, старший преподаватель, кандидат медицинских наук

Коршунов Андрей Сергеевич, ординатор

Хамов Михаил Александрович, интерн

Омская государственная медицинская академия, Россия

Марковский Сергей Олегович, ординатор

МУЗ ГКБ №11, отделение челюстно-лицевой хирургии

Участник конференции

УДК 616.314.13+616.716.4]:611.018.2-007.17

Цель работы: Изучить возможности применения атомно-силовой микроскопии для исследования плотных тканей (кости, зубы).

Материалы и методы исследования: анализ степени упаковки размер и форму костных пластинок, эмалевых призм, а также, размер межпризменного промежутка и его высоту на 30 удаленных зубах и костной ткани у лиц с дисплазией соединительной ткани и 27 удаленных зубах и костной ткани группы контроля методом атомно-силовой микроскопии.

Результаты: Проведено исследование костной ткани и эмали зубов при патологии соединительной ткани в сравнении с пациентами без таковой. Установлено, что компоновка коллагена при патологии соединительной ткани подразумевает увеличение промежутка между волокнами до 98нм, которые снижают количественное содержание минерального матрикса в кости. В эмали зубов также отмечается нарушения форм и размеров эмалевых призм (5,5х5,4 микрон) с увеличением расстояния между эмалевыми призмами до 1,6 микрон.    

Выводы: 1. Результаты исследования ультраструктуры и минерального состава позволяют говорить о нарушении минерализации и организации эмали зубов и костной ткани у  лиц с признаками патологии соединительной ткани. 2. Использование атомно-силовой микроскопии позволяет изучать нативные клеточные культуры, в т.ч. твердые ткани зуба и костную ткань. 3.Указанные факты могут быть использованы, как основа для диагностики патологии соединительной ткани, так и для определения индивидуальных характеристик при идентификации личности.

Ключевые слова: патология соединительной ткани, коллаген, атомно-силовая микроскопия

The purpose of work: To study opportunities of application atomic-force microscopy for morphological diagnostics of a pathology of a connecting fabric on firm fabrics of a teeth and a bone fabric.

Materials and research methods: the analysis of extent of packing the size and the form of bone plates, enamel prisms, and also, the size of an interprismatic interval and its height on 30 remote teeth and a bone fabric at persons from a displaziy connecting fabric both 27 remote teeth and a bone fabric of group of control by a method of nuclear and power microscopy.

Results: Research of a bone fabric and enamel of teeth is carried out at pathology of a connecting fabric in comparison with patients without that. It is established that collagen configuration at pathology of a connecting fabric means increase in an interval between fibers to 98нмwhich reduce the quantitative contents mineral матриксаin a bone. In enamel of teeth also it is noted violations of forms and the sizes of enamel prisms (5,5х5,4 microns) with increase in distance between enamel prisms to 1,6 micron.

Conclusions: 1. Results of research of ultrastructure and mineral structure allow to speak about violation of a mineralization and the organization of enamel of teeth and a bone fabric at persons with symptoms of pathology of a connecting fabric. 2. Use of nuclear and power microscopy allows to study nativny cellular cultures, including firm fabrics of tooth and a bone fabric. 3. The specified facts can be used, as a basis for diagnostics of pathology of a connecting fabric, and for definition of individual characteristics of the personality.

Keywords: pathology of a connecting tissue, collagen, atomic-force microscopy.

Введение. Исследования клеточных структур микроскопическими методами на сегодняшний день являются основополагающими для диагностики патологических процессов, и главным из них остается оптическая микроскопия [1,4,5]. При исследовании костной ткани и твердых тканей зубов, несмотря на необходимость придерживаться строгой последовательности методики изготовления  микропрепаратов, требующей длительного периода времени для лучших результатов одновременной фиксации и декальцинации оптическая микроскопия остается, чуть ли не единственным способом оценки патологических изменений, даже не учитывая некоторые неизбежные изменения (набухание коллагеновых структур, микроразрушения кристаллической решетки гидроксиапатитов), что нежелательно, особенно в случаях патологии соединительной ткани [2,3,9].

Помимо рутинных методов микроскопии, лежащих в основе всех исследовательских программ, для изучения ультраструктур клетки и клеточных мембран в настоящее время используются электронная микроскопия, сканирующая, зондовая микроскопия. Метод электронной микроскопии известен давно, в то время как методы сканирующей микроскопии развиваются не более 2 десятилетий. Атомно-силовая микроскопия (АСМ) применяется для исследования гистологических препаратов пока чрезвычайно редко: стандартные способы подготовки образцов для АСМ позволяют исследовать поверхность образца, но не его внутреннюю структуру [4,6,10].

Сканирующая туннельная микроскопия и АСМ являются наиболее перспективными представителями сканирующей зондовой микроскопии, причем она не требует обязательной электрической проводимости исследуемых образцов, то есть образцы не нуждаются в предварительной обработке [3,7,8].

Цель работы. Изучить возможности применения АСМ для морфологической оценки плотных тканей (кости, зубы).

Материалы и методы исследования. Исследование проводилось на 57 пациентах в возрасте от 20 до 40 лет (из них 49 мужчин и 8 женщин), у которых после травмы в области угла нижней челюсти был удален 8 зуб из линии перелома. По результатам анкетирования и общеклинического обследования сформировано 2 группы пациентов. Основная группа пациентов с дисплазией соединительной ткани в количестве 30 (из них 25 мужчин и 5 женщин), и контрольная группа – без дисплазии соединительной ткани в количестве 27 человек (из них 23 мужчин и 4 женщины). Морфологическое исследование выполнено на 57 зубах, которые были консервированы после удаления, одномоментно помещались в нейтральный 10% раствор формалина. По разработанной методике подготовлены шлифы медиального щечного бугра, обработанные с использованием полировально-шлифовального станка Нейрис, шлифовальных кругов hermesс разной степенью зернистости, и полировальных кругов с алмазной суспензией Akasel, а также травления ортофосфорной кислотой системы марки «Evicrol».

Отсмотр образцов осуществлялся на оптическом микроскопе марки Olympusjx41, с увеличением 1000крат, при этом изучалось микроскопическое строение костной ткани и эмали зубов нижней челюсти. Ультраструктурное строение изучалось с использованием сканирующего зондового микроскопа SolverPro(NT– MPT, Россия). Анализ образцов АСМ–изображения осуществлялся с использованием программного модуля обработки изображения ImageAnalysisNT– VDT. В результате были получены цифровые снимки зубов у обследуемых лиц, по которым осуществлялся  анализ степени упаковки и форму эмалевых призм, размер эмалевых призм, размер межпризменного промежутка и его высоту, размер оболочки эмалевых приз у группы контроля и лиц с патологией соединительной ткани.

Морфологическое исследование 57 костных объектов (нижняя челюсть) было выполнено с применением описанной выше методики.

Результаты. По качественным характеристикам костной ткани плотное вещество состояло из тонких костных пластинок, границы которых на поперечных шлифах кости выступали весьма четко, так как полости костных пластинок в плотном костном веществе располагались, как правило, между соседними пластинками. Местами костные пластинки соприкасались друг с другом, местами же между ними располагались вставочные пластинки.

По качественным характеристикам эмалевых призм зуба, у лиц без патологии соединительной ткани имело место постоянство структуры в виде упорядоченных шестигранных и даже семигранных, с аркообразными формами эмалевых призм. В исследуемой группе с патологией соединительной ткани призмы были расположены хаотично, они имели и пятигранную и шестигранную структуру, с разнообразными формами в виде различных геометрических фигур. При зондовой микроскопии эмали зубов на нижней челюсти видно, что у лиц с патологией соединительной ткани эмалевые призмы отличались меньшими размерами, как в горизонтальной, так и вертикальной плоскостях. Параллельно этому следовало уменьшение эмалевых призм в единице объема, что говорит о менее плотной их упаковке. Достоверное увеличение расстояния между эмалевыми призмами, увеличение высоты межпризменного промежутка у данной категории пациентов говорит об увеличение общей доли органического вещества в полностью прорезовшихся зубах. Величина оболочки эмалевой призмы у лиц с патологией соединительной ткани отличалась большими размерами (табл.1).

Таблица №1.

Количественные характеристики минерального матрикса эмали зубов  у обследуемых лиц (зондовая микроскопия)

Параметры /

Группы обследуемых лиц

 

Размер эмалевых призм в горизонтальной плоскости (dх), микрон

Размер эмалевых призм в вертикальной плоскости (dу), микрон

Количество эмалевых призм в ед. объема (10*10 микрон)

Расстояние между эмалевыми призмами, микрон

Величина оболочки призмы, микрон

Высота межпризменного промежутка

микрон

Группа пациентов без  ДСТ (n= 27)

 

6,3 ± 0,2

 

 

6,25 ± 0,3

 

 

6,2 ± 0,2

 

0,32±0,02

 

0,19±0,03

 

 

19,8 ± 2,5

 

Группа пациентов с ДСТ (n= 30)

 

5,5 ± 0,3*

 

 

5,4 ± 0,1*

 

 

5,2± 0,1*

 

 

1,5 ± 0,1*

 

 

0,8 ± 0,2*

 

 

84,5 ± 2,9*

 

Примечание: * Достоверность различий между основной (пациенты с ДСТ) и контрольной группами р<0,05

При зондовой микроскопии костной ткани нижней челюсти видно, что молекулы коллагена не были связаны между собой "конец в конец", а между ними имелся промежуток в 35 - 40 нм. Предполагается, что в костной ткани эти промежутки играют роль центров минерализации, где откладываются кристаллы фосфата кальция. При атомно-силовой микроскопии  фиксированные и контрастированные фибриллы коллагена выглядели поперечно исчерченными с периодом 67 нм, который включает одну тёмную и одну светлую полоски, с диаметром в среднем 100 нм. Считают, что такое строение максимально повышает сопротивление всего агрегата растягивающим нагрузкам.  При этом, у лиц с патологией соединительной ткани, мы наблюдали, что сопоставимые измерения длины и поперечника коллагеновых волокон сильно варьировали, с увеличением промежутка между волокнами до 98нм (в среднем 84нм), и уменьшения поперечного размера волокон до 40нм (в среднем 56нм). При этом, сопоставление размеров минеральных пластин между коллагановыми волокнами в костной ткани нижней челюсти как у лиц с патологией соединительной ткани, так и в группе сравнения, статистически достоверной разницы не наблюдалось (табл. 2)

Таблица №2.

Количественные характеристики минерального матрикса у обследуемых лиц (зондовая микроскопия)

Параметры /

Группы обследованных

Размер коллагеновых волокон в горизонтальной плоскости (dх), нм

Размер коллагеновых волокон в вертикальной плоскости (dу), нм

Размер минеральных пластин в горизонтальной плоскости (dх), нм

Размер минеральных пластин в вертикальной плоскости (dу), нм

группа пациентов без ДСТ (n= 27)

61,4 ± 8,5

98,7 ± 23,3

61,4 ± 9,5

5,4 ± 1,3

группа пациентов с ДСТ (n= 30)

84,7 ± 14,2*

56,0±17,4*

74,7 ± 9,4*

9,0± 2,3*

Примечание: * Достоверность различий между основной (пациенты с ДСТ) и контрольной группами р<0,05

При оценке результатов исследования костной ткани видно, что основным различием между группой контроля и пациентами с патологией соединительной ткани является наличие пустот, что влечет за собой изменения структуры залегания минеральных элементов кости, изменение формирования костных пластинок, а также изменение количества минеральных компонентов в единице объема кости.

По результатам исследования эмали зубов видно, что основным различием между группой контроля и пациентами с патологией соединительной ткани является наличие гипоминерализованной структуры кристаллической решетки гидроксиапатитов, неправильной их пространственной ориентацией, что влечет за собой изменение залегания органического матрикса, нарушение формирования полноценной структуры эмали, вследствие нарушения нормального взаимоотношения органического матрикса и минерального компонента, несвойственных данному периоду созревания эмали зубов.

Выводы.

1.По результатам исследования ультраструктуры и минерального состава можно говорить о нарушении минерализации и организации эмали зубов и костной ткани у  лиц с признаками патологии соединительной ткани. Это объясняется недостаточно плотной упаковкой эмалевых призм, костных пластинок в единице объема, их хаотичным расположением, недостаточно организованным и минерализованным органическим матриксом.

2. Достоинством этого метода является возможность изучения микрорельефа поверхности без предварительной обработки, деформирующей клеточные структуры. Исследования срезов на АСМ дают возможность получать изображения, сопоставимые с малым увеличением (менее ~25000) просвечивающего электронного микроскопа. Дальнейшее развитие методик позволит использовать АСМ как основной метод исследования тканей, используемый в сочетании с другими видами микроскопии.

3. Результаты демонстрируют возможность использования АСМ для изучения нативных клеточных культур, в т.ч. твердых тканей зуба и костной ткани как в судебно-медицинской так и стоматологической практиках с возможностью определения индивидуальных характеристик, так и в клинике – диагностика патологических процессов и контроль качества лечения пациентов с патологией соединительной ткани. Вопрос об использовании АСМ для исследования особенностей костной ткани и твердых тканей зубов при диспластических процессах, таких как синдром Педжетта, синдром Марфана, синдром Элерса-Данло и т.д., заслуживает дальнейшего изучения.

Литература:

  1. CadetER, GafniRI, McCarthyEF, McCrayDR, BacherJD, BarnesKM, etal. Mechanisms responsible for longitudinal growth of the cortex: coalescence of trabecular bone into cortical bone // J Bone Jt Surg, Am – 2003. – Vol. 85. – Р. 39– 48.
  2. Chiego D.J. The early distribution and possible role of nerves during odontogenesis // Int. J.Develop.Biol. – 1995. – Vol.39, №1. - P. 191 – 194.
  3. Gao HJ, Ji BH, Jager IL, Arzt E, Fratzl P. Materials become insensitive to flaws at nanoscale: lessons from nature // PNAS. – 2003. – Vol. 100. – Р. 597– 600
  4. Gutsmann T, Fantner GE, Venturoni M, Ekani-Nkodo A, Thompson JB, Kindt JH, et al. Evidence that collagen fibrils in tendons are inhomogeneously structured in a tubelike manner // Biophys J. – 2003. Vol. 84. – P. 93–103.
  5. Московский С.Н. Патология костной ткани у лиц с дисплазией соединительной ткани и злоупотребляющих алкоголем: судебно-медицинская оценка / Московский С.Н., Конев В.П., Голошубина В.В. //  Сибирский медицинский журнал, Том 26,1 Томск – 2011 с. 27-30.
  6. Lees S. Mineralization of type I collagen // Biophys J. –2003.- Vol. 85. №20. – P. 4 –7.
  7. Ng L, Grodzinsky AJ, Patwari P, Sandy J, Plaas A, Ortiz C. Individual cartilage aggrecan macromolecules and their constituent glycosaminoglycans visualized via atomic force microscopy // J Struct Biol. – 2003. – Vol. 143, №2. – Р. 42– 57.
  8. Roschger P, Gupta HS, Berzanovich A, Ittner G, Dempster DW, Fratzl P, et al. Constant mineralization density distribution in cancellous human bone // Bone. – 2003. – Vol. 32, № 3.- Р. 16– 23.
  9. Rubin MA, Jasiuk L, Taylor J, Rubin J, Ganey T, Apkarian RP. TEM analysis of the nanostructure of normal and osteoporotic human trabecular bone // Bone. – 2003. – Vol.33, № 3. -  Р. 270– 82.
  10. Venturoni M, Gutsmann T, Fantner GE, Kindt JH, Hansma PK. Investigations into the polymorphism of rat tail tendon fibrils using atomic force microscopy // Biochem Biophys Res Commun. – 2003. Vol.30, № 50. – Р. 8– 13.
  11. Tong W, Glimcher MJ, Katz JL, Kuhn L, Eppell SJ. Size and shape of mineralites in young bovine bone measured by atomic force microscopy // Calcif Tissue Int. – 2003. – Vol. 75, №59. – Р. 2– 8.
Комментарии: 9

Чичкова Марина Александровна

Очень интересная работа. Атомно-силовая микроскопия возможно откроет новые возможности в исследовании плотных тканей. а также, возможно, системных аномалий развития. Успехов!

Stepanov Yuriy Mironovich

Авторам благодарность за интересную работу. Есть небольшая помарка: вначале исследования было 49 мужчин и 8 женщин, когда их разбили на две группы оказалось 48 мужчин и 9 женщин.В остальном достойная работа. С уважением, В.Диденко. vladdidenko23@gmail.com

Stepanov Yuriy Mironovich

Очень интересная работа. Скажите, пожалуйста, каие возможности применения метода в гастролєнтерологии?

Мойсеенко Валентина

Работа актуальная и очень перспективная, поскольку существует много заболеваний к которым современная наука ищет подходы. Успехов в дальнейшем.

Морозова Елена Николаевна

Работа интересная. Как известно из студенческих учебников эмаль является продуктом эктодермального происхождения, а соединительная ткань- мезодермального и ее производного мезенхимы. Дисплазия насколько известно - это генетические нарушения, связанные с структурой соединительной ткани. Изменения в эмали интересные, объясните как они связаны с дисплазией соединительной ткани?

Лахтин Юрий Владимирович

Здравствуйте, уважаемые авторы. Действительно, метод АСМ более современный метод исследования минерализованных тканей и имеет определенные преимущества перед растровой микроскопией. У меня возникло ряд вопросов, в частности, по методике исследования. Зубы мудрости, которые Вы брали на исследование, были интактными или кариозными?.. витальными или девитальными? ... на подготовительном этапе до АСМ исследовали ли вы кислотоусточивость эмали зубов? Вами перед исследованием образцы тканей подвергались протравливанию. Все эти моменты могли повлиять на результаты: размеры тела призм, межпризменные промежутки. Известно, что в зависимости от состояния кислотоустойчивости эмали зубов люди подразделяются (клинически) на кариесрезистентных и кариесвосприимчивых. Что касается костной ткани. У пациентов, которым проводились исследования, учитывались признаки поражения тканей пародонта? Сопутствующий пародонтиту остеопороз также накладывает свой отпечаток на структурную организацию кости. Насколько полученные данные являются референсными для диагностики дисплазии с/тк? Описанные Вами изменения в эмали зубов методом АСМ мы получали при отравлении солями тяжелых металлов низкой концентрации, правда с помощью растровой ЭМ. Поэтому хотелось бы узнать у Вас, какова чувствительность и специфичность предложенного Вами метода при поражениях соединительной ткани? Столько возникших вопросов вызвано проявленным интересом к Вашей работе, которая заслуживает внимания и в перспективе может развиться в целое научное направление. Заранее спасибо за ответы. Желаю вашему научному коллективу дальнейших успехов. С уважением, Ю.В. Лахтин.

Norbert Borkach (Bark?ts)

Очень интересная работа. Атомно-силовая микроскопия, безусловно, имеет большое будущее в исследовании плотных тканей. Применялись ли Вами другие методы (например электронно-микроскопические) для морфологической оценки ткани?

Вокина Вера Александровна

Здравствуйте, я не специалист в данной области, но меня заинтересовал метод, описанный Вами. Скажите, пожалуйста, возможно ли применять данный метод при работе с мелкими грызунами(крысами) для оценки изменений вследствие воздействия вредных веществ? Или оценивать уровень накопления вредных веществ в тканях животных?

Fateev Ivan Nikolaevich

В работе указано, что отсмотр образцов осуществлялся на оптическом микроскопе марки Olympusjx41, с увеличением 1000крат, при этом изучалось микроскопическое строение костной ткани и эмали зубов нижней челюсти. Возможно ли на этом этапе установить возможность использования атомно-силовой микроскопии для исследования плотных тканей?
Комментарии: 9

Чичкова Марина Александровна

Очень интересная работа. Атомно-силовая микроскопия возможно откроет новые возможности в исследовании плотных тканей. а также, возможно, системных аномалий развития. Успехов!

Stepanov Yuriy Mironovich

Авторам благодарность за интересную работу. Есть небольшая помарка: вначале исследования было 49 мужчин и 8 женщин, когда их разбили на две группы оказалось 48 мужчин и 9 женщин.В остальном достойная работа. С уважением, В.Диденко. vladdidenko23@gmail.com

Stepanov Yuriy Mironovich

Очень интересная работа. Скажите, пожалуйста, каие возможности применения метода в гастролєнтерологии?

Мойсеенко Валентина

Работа актуальная и очень перспективная, поскольку существует много заболеваний к которым современная наука ищет подходы. Успехов в дальнейшем.

Морозова Елена Николаевна

Работа интересная. Как известно из студенческих учебников эмаль является продуктом эктодермального происхождения, а соединительная ткань- мезодермального и ее производного мезенхимы. Дисплазия насколько известно - это генетические нарушения, связанные с структурой соединительной ткани. Изменения в эмали интересные, объясните как они связаны с дисплазией соединительной ткани?

Лахтин Юрий Владимирович

Здравствуйте, уважаемые авторы. Действительно, метод АСМ более современный метод исследования минерализованных тканей и имеет определенные преимущества перед растровой микроскопией. У меня возникло ряд вопросов, в частности, по методике исследования. Зубы мудрости, которые Вы брали на исследование, были интактными или кариозными?.. витальными или девитальными? ... на подготовительном этапе до АСМ исследовали ли вы кислотоусточивость эмали зубов? Вами перед исследованием образцы тканей подвергались протравливанию. Все эти моменты могли повлиять на результаты: размеры тела призм, межпризменные промежутки. Известно, что в зависимости от состояния кислотоустойчивости эмали зубов люди подразделяются (клинически) на кариесрезистентных и кариесвосприимчивых. Что касается костной ткани. У пациентов, которым проводились исследования, учитывались признаки поражения тканей пародонта? Сопутствующий пародонтиту остеопороз также накладывает свой отпечаток на структурную организацию кости. Насколько полученные данные являются референсными для диагностики дисплазии с/тк? Описанные Вами изменения в эмали зубов методом АСМ мы получали при отравлении солями тяжелых металлов низкой концентрации, правда с помощью растровой ЭМ. Поэтому хотелось бы узнать у Вас, какова чувствительность и специфичность предложенного Вами метода при поражениях соединительной ткани? Столько возникших вопросов вызвано проявленным интересом к Вашей работе, которая заслуживает внимания и в перспективе может развиться в целое научное направление. Заранее спасибо за ответы. Желаю вашему научному коллективу дальнейших успехов. С уважением, Ю.В. Лахтин.

Norbert Borkach (Bark?ts)

Очень интересная работа. Атомно-силовая микроскопия, безусловно, имеет большое будущее в исследовании плотных тканей. Применялись ли Вами другие методы (например электронно-микроскопические) для морфологической оценки ткани?

Вокина Вера Александровна

Здравствуйте, я не специалист в данной области, но меня заинтересовал метод, описанный Вами. Скажите, пожалуйста, возможно ли применять данный метод при работе с мелкими грызунами(крысами) для оценки изменений вследствие воздействия вредных веществ? Или оценивать уровень накопления вредных веществ в тканях животных?

Fateev Ivan Nikolaevich

В работе указано, что отсмотр образцов осуществлялся на оптическом микроскопе марки Olympusjx41, с увеличением 1000крат, при этом изучалось микроскопическое строение костной ткани и эмали зубов нижней челюсти. Возможно ли на этом этапе установить возможность использования атомно-силовой микроскопии для исследования плотных тканей?
Партнеры
 
 
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
Would you like to know all the news about GISAP project and be up to date of all news from GISAP? Register for free news right now and you will be receiving them on your e-mail right away as soon as they are published on GISAP portal.