facebook
twitter
vk
instagram
linkedin
google+
tumblr
akademia
youtube
skype
mendeley
Page translation
 

A NOVEL COLORIMETRIC BIOSENSOR FOR DETERMINATION OF CATIONIC SURFACTANTS

A NOVEL COLORIMETRIC BIOSENSOR FOR DETERMINATION OF CATIONIC SURFACTANTS A NOVEL COLORIMETRIC BIOSENSOR FOR DETERMINATION OF CATIONIC SURFACTANTS
Olena Koval'ska, assistant, candidate of pharmaceutics

Blazheyevskiy Mykola Evstahiyovich , professor, ph.d. of chemistry, full professor

National University of Pharmacy, Ukraine

Championship participant: the National Research Analytics Championship - "Ukraine";

the Open European-Asian Research Analytics Championship;

UDC543.395: 543.23: 543.422.7

A novel colorimetric biosensor for the determination of acetylcholinesterase (AChE) activity and its inhibitors on example of cationic surfactant Benzalkonium chloride (BAC) in aqueous solutions by taking utilization of H2O2 – 4- ethoxyaniline (p-Ph) detection system has been proposed. In the presence of AChE, acetylcholine (ACh) was hydrolyzed to choline and acetic acid. H2O2 could interact with unreacted ACh and in situ formed CH3CO3H can the oxidize p-Ph to azoxyphenetole (ox p-Ph), resulting in a light brown color developing and an increase of the absorbance at 350 nm. A colorimetric method developed for estimating acetylcholinesterase activity using ACh as substrate measures the rate ox- p-Ph formation and assay of the cationic surfactant BAC is highly sensitive with a low detection limit of 6∙10-7 mol/L. The obtained assay is fairly simple, inexpensive, which may be used for the screening trace amount of cationic surfactants.

Keywords: cationic surfactant, colorimetric biosensor, Benzalkonium chloride.

 

Introduction

At present time monitoring of environment, in particular, permanent control of the presence of toxicants, has become to priority. Surfactants, in particular a quaternary cationic nitrogen atom (QAC), are one of the widespread pollutants of surroundings.

Cationic surfactants are one of the widespread pollutants of the surroundings. They are presented at composition of personal hygiene, numerous washing and cleaning agents, etc. After being used, surfactants are discharged in to the environment in huge volumes that result in contamination of water ecosystems [1, 2]. Moreover, due to their ability to increase solubility of other pollutants, it’s found in water in higher concentration [3].

The main analytical methods of cationic surfactants determination include different types LC [4-8], spectrophotometric with liquid-liquids extraction [9-13], spectrophotometricwith solid - phase extraction [14], spectrofluorimetry (SFl) [15], colorimetry [16-18], and potentiometric determination with ISE [19, 20]. Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy without the requirement for solvent extraction, dilution or filtration was proposed too [12].

The complex and high cost equipment, highly skilled personnel to service, time- and cost-consuming sample pretreatment are the limitations of discussed methods. Consequently, the creation of more functional accurate, selective, fast and low-cost method is actually necessary.

It should be noted, that in recent years, biosensors become an accepted part of analytical chemistry [21]. The literature review presented several biosensors for determination of cationic surfactants. At this point, the development of biosensors seems to be promising approach.

Cholinesterase is vital enzyme for human organism. It’s needed for proper function of the nervous system. Simultaneously, the using of the Cholinesterase – based biosensors allows to determine the trace amounts of surfactants in environment. Due to its properties, Cholinesterase – based biosensors deserves attention.

The detection schemes include amperomertric [22, 23], potentiometric [24, 25], conductometric [26, 17], optical [16], fluorometric [27] and piezoelectric [28] transduction models.

Here we present an alternative method employing for the determination cationicsurfactans, namely Benzalkonium chloride (BAC).

BACbelongs to a series of quaternary ammonium chloride homologues with the structure shown in Figure 1.

 

Fig. 1. Structure of Benzalkonium chloride. The C12, C14 and C16 homologues are the most common homologues found in consumer products.

The pervasive use of BAC in consumer products results from its antiseptic and antifungal properties with widespread applications ranging from cleaning products and disinfectants to sanitizing wipes and ophthalmic solutions.

Because of its extensive use BAC has been the subject of numerous studies, including the evaluation of the reactivity of BAC with ocular tissue and the study of more wide municipal wastewater, which found BAC to be most prevalent quaternary ammonium compound in wastewater, with concentrations ranging between 200 and 300 mg/L [20].

2. Materials and methods

For light absorbance of solutions “photoelectric concentration colorimeter («CPС-2»)” was used (Zagorsky Optical & Mechanical Plant, Russia). Using the filter №2 (λmax = 354 nm) and quartz cell of 1.0 cm.

pH value was measured at Ionomer I - 160M laboratory (Belarus) by using EGL 43-07 pH glass laboratory electrode together with auxiliary chloride silver electrode of EAL-1М3.1 type, saturated with potassium chloride.

For research reagents were used: p- Phenetidine (4 - ethoxyaniline - 98%) (SIGMA - ALDRICH); A0281408 series, New Jersey, USA; p-Phenetidine hydrochloride (p-Ph), extracted from the base by hydrogen chloride precipitation in the chloroform solution.

Pharmacopoeical acetylcholine chloride medicine - 0.2 g per amp/5 ml (manufactured by "VECTOR" – State Science Center of virology and biotechnology in Russian Federation" (Russia).

Dry protein drug of cholinesterase from horse serum was taken - 80 mg / fL (VI class), 22 AЕ / mg (manufactured by SMU "Biomed", Russia).

"Stabilized Hydrogen Peroxide 30-40%" (LLC "Inter - Synthes", Boryslav, Ukraine); The content of hydrogen peroxide was determined by SPU.

Benzalkonium chloride(ArquadMCB-50 alkylbenzyldimethylammonium chloride, МW=352.5 g/mol), production«Akro Nobel Surface Chemistry AB», Stenungsund,Sweden.

The preparation solution ofenzyme substrate of acetylcholine chloride (ACh)

The ampoule’s content of pharmacopoeia drug acetylcholine chloride 0.2 g is in 200 ml of double-distilled water dissolved. For that end, open an ampoule, add 4.0 ml of water with pipette, and shake until acetylcholine is completely dissolved. Then pour the acetylcholine solution quantitatively transferred into 200 ml capacity measuring bottle and dilute double-distilled water to the volume.

Cholinesterase solution preparation (ChE).

Add 10.0 ml double - distilled water in a flask, containing 80 mg of dry cholinesterase drug, shake up and thermostat for 10 minutes at 38 °C above Zero.

Phosphate buffer solution preparation (pH 8.35).

Pour 35.75 g of disodium hydrogen phosphate in 500 ml flask, add 300 ml double-distilled water, dissolve it, add 19 ml of 0.1 mol/L solution of hydrochloric acid, stir and dilute double distilled water to 500.0 ml. The ready solution pH is potentiometrically controlled.

Hydrogen peroxide solution 10%. It is prepared by the appropriate high-test hydrogen peroxide dilution with double-distilled water. The exact hydrogen peroxide content in ready 10% solution is determined permanganatometrically.

p-Phenetidine hydrochloride solution preparation 1%.

Dissolve 1.00 g p-phenetidine hydrochloride in 80 ml of double-distilled water into 100 ml capacity measuring bottle and dilute it to volume.

Preparationworking standard solution(WSS) 2.8·10-5mol/L

WSS prepared in double distilled water. Sweep down 0.09910 g (precisely weighed quantity)standard solution of Benzalkonium chloride in 500 ml capacity measuring flask and it was diluted up to the mark. 1.00 ml of the ready solution is transferred with pipette in 100 ml capacity measuring flask. After this, dilute with double - distilled water to volume at 20ºC, cork the flask and mix thoroughly.

WSS was prepared containing 2.8∙10-5mol/L of BAC.

Preparationof Calibration Curve

In a graduated test tubes with ground plug gradually add phosphate buffer (pH = 8,4) 10.0 ml of 0.2 mol / L in each one, respectively, from 1.00 ml to 5.00 ml of Benzalkonium chloride solution (WSS)and add 2.0 ml of cholinesterase while stirring, switch a timer, shake up each solution thoroughly and thermostate for 20 min, then quickly add 1.0 mL of 1% acetylcholine solution, switch on timer, shake thoroughly and thermostate 10 min again, then add 2.0 ml of 10% hydrogen peroxide solution, keep for 10 min in thermostat and add 1.0 ml of 1% p-phenetidine solution (p-Ph) , dilute distilled water to volume at 20 ml. Switch on timer and every other minute scan photometrically each solution for 20 min on photoelectric colorimeter CPC-2, use colour filter №2 and 1.0 cm cuvette. Every time before test tube contents shaking, plug it thoroughly. Buffered solution with double - distilled water as reference solution is used.

According to the optical - time relations the kinetic curves are plotted and the slope of the first 10 minutes is found. According to data received a slope - finite analyte concentration calibrated relation is obtained, c, µmol/L. A calibration curve equation is solved by the least squares method (Linear regression): tgα = b·с + a, where a, b are Y-axis intercept and slope, (tgα, min-1) respectively.

Standard technique forBenzalkonium chloride in sample of model solution determining.

In a graduated test tubes with ground plug gradually add phosphate buffer (pH = 8.4) 10.0 ml of 0.2 mol / L, than a certain amount (volume) (1.0 - 5.0 ml) test inhibitor and carry out determination like an experiment of “Calibration Curve”. All experiments were repeated 5 times.The concentration of BAC in standardized test solution is calculated by formula:

tgα - is a slope, available from operational experiment, min -1;

a, b- Y-axis intercept and slope of calibration curve equation (tgα = bc + a), respectively.

Results and their discussion:

We proposed a new sufficiently sensitive original biosensor for determining small amounts of surfactants – inhibitors acetylcholinesterase.

The functioning of biosensor is based on the ability surfactants inhibit the catalytic activity of the enzyme acetylcholinesterase (AChE) in the hydrolytic reaction of decomposition of acetylcholine-substrate (ACh). At present established mechanism competitive inhibition effect on enzymatic hydrolysis of acetylcholine by surfactants: anionic active site on the surface of AChE interact with positively charged nitrogen atom surfactants (BAC), which prevents sorption of positively charged substrate acetylcholine and thus leads to slower reaction of its hydrolysis [30].

Biosensor working based on conjugated system of two consecutive reactions - perhydrolysis of acetylcholine and had caused reaction peroxyacetic acid oxidation of p-Phenetidine. As a result of the last indication reaction azoxyphenetole (oxp-Ph ) was produced, which capable to intense light absorption. Measuring the rate of change of the absorption of light in time (conditional reaction rate) can determine the content of a surfactant - AChE inhibitor (Fig. 2)

Fig. 2. Scheme of the reactions underlying the determination of benzalkonium chloride by enzyme-kinetic photometric method.

 

 Found that in the range pH 8.2-8.5 rate of formation of 4-azoxyphenetoll (as the result of oxidation of p-Phenetidine by peracetic acid, which formed in the previous reaction perhydrolysis of residue acetylcholine) strictly proportional to the concentration of inhibitor [31].

Fig. 2; Kinetic curves of couple oxidation p- phenetidine by hydrogen peroxide in presence of the system: 1 – ACh+ChE, 2- 6 –ACh+(ChE+BAC) , 7 – AСh. w(ACh) = 0.1%; ChE = 0.25 U;c(BAC, 10-6 mol/L: 2–1.4, 3– 2.8, 4–3.4, 5 –5.6 , 6 – 7.0.

 

Figure 2 shows the kinetic curves of couple oxidation of p-phenetidine by hydrogen peroxide in presence of different concentrations of BAСwith a linear character at the initial stage. This enables the use for assessing the reaction rate of slope angle tangent (angular coefficient of slope) of the derived kinetic lines, built in the coordinates optical density (A) - time (t, min) min-1 as the value of the analytical signal, corresponding to a certain content of an inhibitor in a sample.

Fig. 3: Curve of the graduated dependence of the indicator reaction rate of Ach hydrolysisin presence of (ChE+BAС) vs. BAС concentration.

 

The resulting dependence of the calibration indicator reaction (tgα, min-1) concentrations of BAC is suitable to determine it in the model solutions, was shown in Fig. 3. The equation of calibration curve looks like: tgα = 2500 c + 0.0053 (r = 0.998).

Table 1 shows the results of quantitative determination BAC in model solutions by calibration curve.

Limit of quantitation (LOQ) was calculatedof the reaction, which was 0.6∙10-6 mol/L, was calculated as:

a - free term in equation calibration curve tg α= 2500∙c+ 0,0053 (r= 0,998);

b - angularcoefficient in equation calibration curve.

Table 1

Metrological characteristics of results ofBenzalkonium chloride kinetic determination in model solutions

No.

BAC taken,

mol /L

BAC found,

n, 10-6 mol /L

Metrological characteristics (Р=0.95, n=5))

1.

1.41∙10-6

1.33

1.37

1.41

1.42

1.45

=1.3910-6

S=0.05∙10-6

S=0.02∙10-6

=0.06∙10-6

RSD=3.34%

δ=1.42%

2.

2.815∙10-6

2.87

2.73

2.85

2.83

2.83

 

=2.8210-6

S=0.05∙10-6

S=0.02∙10-6

=0.75∙10-6

RSD=1.91%

δ=0.18%)

3.

4.22 10-6

4.32

4.19

4.22

4.22

4.23

=4.23∙10-6

S=0.05∙10-6

S=0.02∙10-6

=0.06∙10-6

RSD=1.2%

δ= -0.24  %

4.

5.62∙10-6

5.60

5.69

5.55

5.69

5.62

=5.63∙10-6

S=0.06∙10-6

S = 0.03∙10-6

=0.075∙10-6

RSD=1.00%

δ=0.18%

5.

7.00∙10-6

7.00

7.05

7.09

7.01

7.00

=7.03∙10-6

S=0.039∙10-6

S = 0.01∙10-6

=0.05∙10-6

RSD=0.56%

δ*=-0.47%

δ*=(-μ)∙100% /μ

When determined of BAC in the concentration range of 1.4∙10-6  ... 7∙10-6 mol/L RSD ≤ 3.34 % (δ=-0.47… +1.42).Since δ <RSD the results of the analysis accept as correct.

Conclusion

A new sensitive and specific enzyme-kinetic method for determination of cationic surfactant BAC in water solutions was presented. LOQ was calculatedof the reaction, which was 6∙10-7 mol/L. The method has satisfactory reproducibility and accuracy. At determining the concentration of BAС within 1.4∙10-6 …7∙10-6 mol /Lin model solutions RSD were ≤ 3. 34%  (δ = + 1.42% ... -0.47%).

 

References:

  • 1.        Perez L. et al. // Eur. J. Med. Chem. – 2009. – V.44. – P.1889-1892.
  • 2.        Olkowska E., Polkowska A., Namie´snik J. // Talanta. – 2012. – V. 88. P. 1-13.
  • 3.        Kucherenko I.S. et al. // Meas. Sci. Technol. – 2012. – V.23. Online at stacks http://iopscience.iop.org/0957-0233/23/6/065801
  • 4.        DíezC., et al. //Food Anal.Meth. –2016. – V. 9,No2. – P. 485-499.
  • 5.        Afshar Z. GH., Parham H. // Asian J. Chem. – 2011 – V. 23, No.10 - P. 4464-4466.
  • 6.        Simone C. Chiapetta et al. // J. Braz. Chem. Soc. – 2011 –V.22, No10.– P.1913-1920.
  • 7.        Liu Y., at al. // Chin. J. chromatog. – 2011. –V. 29, No 5. – P.458-461.
  • 8.        Bertuzzi T., Pietri A.  // Food Anal. methods. – 2014. - No7. – P. 1278-1284.
  • 9.        MaW., MaX., ShaOu, YinghongLiu// J. Surfact. Deterg.– 2014. -V. 17, Jan. –  P. 177-181.
  • 10.    Momohara Ik. еt al. //J. Wood Sci. – 2010. – V.56, No 4. – P.314-318.
  • 11.    Lavorgna M. et al.  // Journal: Enver. Poll. - 2016. – V. 210. –P. 34.
  • 12.    Nathan W., Gill Mc. // Defence Science and Technology Organisation -DSTO-TN-1132 -2012. –10 p.
  • 13.     Vkds Sai et al. // Intern. J. Biopharm. – 2013. – V 4, No2. – P. 104-109.
  • 14.     Yokoyama Y., Kubo H., Sato H. // Talanta. – 2008. – V.77, No 2. – P.667-672.
  • 15.    GOST- R 51211-98. Drinking water. Methods of determining the content of surfactants // IPK. Russia,Standards Publishing House 1998.
  • 16.    Pogaĉnik L., Franko M. // Biosens. Bioelectron. –2003.– V.18. – P.1-9.
  • 17.    Dzyadevych S. V. et al. // Sensors Actuators B. –2005. – V.105. – P. 81-7.
  • 18.    Maducnić-Čačić D et al. // Talanta.  – 2008. – V.76. – P. 259-264.
  • 19.    Mohamed G. at all. // Anal. Chim. Acta. –V. 673, No1. – P.79-87.
  • 20.    Abbas M. N., Mostafa G.A.E., Homoda A.M. // Talanta. – 2000. –V. 53, No 2. – P. 425-432.
  • 21.    Nomura Y. et al. // Biosens. Bioelectrod. – 1998. – V.13. – P. 1047-53
  • 22.    Gogol E. V. et al.// Talanta.  – 2000. –V. 53. –P. 379-389;
  • 23.    Dzyadevych S.V. et al. // IRBM.  –2008. – V.29. – P. 171-180.
  • 24.    Soldatkin A. P. et al. // Talanta. – 2005. – V.66. – P. 28-33.
  • 25.    Dzyadevych S. V. et al. // Anal. Lett. 2004. – V.37. – P.1611-24.
  • 26.    Dzyadevich S. V. et al. // Electroanalysis. – 1994. – V.6. – P. 752 – 758.
  • 27.    Navas D´ıaz A., Ramos Peinado M.C. //Sensors Actuators B. - 1997. – V. 39. – P. 426-431.
  • 28.    Makower A et al. // Biosens. Bioelectron.  – 2003. –V. 18. – P. 1329-37.
  • 29.    ZhangC., TezelU., LiaD. etal. // WaterRes. 2011. – V.45. – P. 1238-1246.
  • 30.    ZhukovskiyY.G. KuznetsovaL.P., SochilinaE.E. // Ukrain. Biochem. J. – 1995 –V.67, No4 – P.40-46.
  • 31.    BlazheyevskiyM.Ye, DyadchenkoV.V. // Pharmac. J. – 2004. – V.2. – P. 52-58(ukr.).
0
Your rating: None (1 vote)
Comments: 3

Blazheyevskiy Mykola

Уважаемый Геворг Саркисович! Мы с Вами полностью согласны, что нами разработанная методика весьма чувствительна. Целью работы, собственно, и было разработать чувствительную методику, позволяющую определять следовые количества ВАС в разбавленных водных растворах, используя достаточно простой метод фотометрии. Положенная в основу методики биохимическая реакция дополнительно позволяет избирательно выполнять определение в различных объектах, в том числе и в лекарственных препаратах. Но эти данные будут изложены в других наших публикациях. Спасибо Вам!

Olena Koval'ska

Спасибо за столь положительный отзыв о нашей работе. Мы с Вами полностью согласны и уже поготовили две статьи касающихся определения ВАС в лекарственных средствах. Они вскоре появлятся в печати. В связи с регламентованным объемом (количеством страниц) публикаций мы не останавливалить столь детально на вопросе использования ВАС и его свойств, хотя вначале статьи мы затронули эти вопросы кратко. Вопросу применения ВАС и методам его определения в лексредствах посвящена также обзорная статья. Спасибо Вам ещё раз,Геворг Саркисович!

Simonian Geworg

Уважаемые Елена Васильевна и Никола Евстафьевич хорошаяая, аналитическая и практическая работа. Холинэстеразы является жизненно важным ферментом для человеческого организма. Она регулирует функционирования нервной системы. Одновременно с использованием холинэстеразы - на основе биосенсоров позволяет определять следовые количества поверхностно-активного вещества- бензалкония хлорид в окружающую среду. В статье Вамы не приводится слово о том, что бензалкония хлорид является лекарством. Известно, что бензалкония хлорид применяется в медицине как антисептики и дезинфицирующие средства, также оно является негормоналный контрацептик. Бензалкония хлорид это четвертичное аммониевое соединение, которое способно оказывать влияние на обменные процессы, происходящие в клетках, за счет молекулярных связей с белковыми и липидными компонентами клеточных мембран. Являясь катионо-активным веществом, он снижает поверхностное натяжение на границе раздела двух сред, притягивает отрицательно заряженные частицы и микроорганизмы, приводит к повреждению мембран клеток, денатурации внутриклеточных белков, нарушению обменных процессов в клетках, обеспечивая выход жизненно важных компонентов в межклеточное пространство, что, в конечном счете, приводит к гибели микроорганизмов. Вами применен и получен новый чувствительный и специфический фермент-кинетический метод для определения катионного поверхностно -активного вещества хлорида бензалкония с формулой C21H38NCl в водных растворах с концентрацией 6 ∙ 10 -7 моль / л. Метод имеет удовлетворительную воспроизводимость и точность. С увеличением концентрации хлорида бензалкония точность определения увеличается. В конце можно было также приводит как вывод, что метод позволяет определить бензалкония хлорид также в лекарственных средствах. С уважением к.х.н., доцент Геворг Саркисович.
Comments: 3

Blazheyevskiy Mykola

Уважаемый Геворг Саркисович! Мы с Вами полностью согласны, что нами разработанная методика весьма чувствительна. Целью работы, собственно, и было разработать чувствительную методику, позволяющую определять следовые количества ВАС в разбавленных водных растворах, используя достаточно простой метод фотометрии. Положенная в основу методики биохимическая реакция дополнительно позволяет избирательно выполнять определение в различных объектах, в том числе и в лекарственных препаратах. Но эти данные будут изложены в других наших публикациях. Спасибо Вам!

Olena Koval'ska

Спасибо за столь положительный отзыв о нашей работе. Мы с Вами полностью согласны и уже поготовили две статьи касающихся определения ВАС в лекарственных средствах. Они вскоре появлятся в печати. В связи с регламентованным объемом (количеством страниц) публикаций мы не останавливалить столь детально на вопросе использования ВАС и его свойств, хотя вначале статьи мы затронули эти вопросы кратко. Вопросу применения ВАС и методам его определения в лексредствах посвящена также обзорная статья. Спасибо Вам ещё раз,Геворг Саркисович!

Simonian Geworg

Уважаемые Елена Васильевна и Никола Евстафьевич хорошаяая, аналитическая и практическая работа. Холинэстеразы является жизненно важным ферментом для человеческого организма. Она регулирует функционирования нервной системы. Одновременно с использованием холинэстеразы - на основе биосенсоров позволяет определять следовые количества поверхностно-активного вещества- бензалкония хлорид в окружающую среду. В статье Вамы не приводится слово о том, что бензалкония хлорид является лекарством. Известно, что бензалкония хлорид применяется в медицине как антисептики и дезинфицирующие средства, также оно является негормоналный контрацептик. Бензалкония хлорид это четвертичное аммониевое соединение, которое способно оказывать влияние на обменные процессы, происходящие в клетках, за счет молекулярных связей с белковыми и липидными компонентами клеточных мембран. Являясь катионо-активным веществом, он снижает поверхностное натяжение на границе раздела двух сред, притягивает отрицательно заряженные частицы и микроорганизмы, приводит к повреждению мембран клеток, денатурации внутриклеточных белков, нарушению обменных процессов в клетках, обеспечивая выход жизненно важных компонентов в межклеточное пространство, что, в конечном счете, приводит к гибели микроорганизмов. Вами применен и получен новый чувствительный и специфический фермент-кинетический метод для определения катионного поверхностно -активного вещества хлорида бензалкония с формулой C21H38NCl в водных растворах с концентрацией 6 ∙ 10 -7 моль / л. Метод имеет удовлетворительную воспроизводимость и точность. С увеличением концентрации хлорида бензалкония точность определения увеличается. В конце можно было также приводит как вывод, что метод позволяет определить бензалкония хлорид также в лекарственных средствах. С уважением к.х.н., доцент Геворг Саркисович.
PARTNERS
 
 
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
image
Would you like to know all the news about GISAP project and be up to date of all news from GISAP? Register for free news right now and you will be receiving them on your e-mail right away as soon as they are published on GISAP portal.